序列特异性寡核苷酸多态性 PCR
别名:PCR-sequence specific oligonucleotide polymorphism,PCR-SSOP
最新修订时间:
简介
序列特异性寡核苷酸多态性 PCR,英文名是 PCR-sequence specific oligonucleotide polymorphism, PCR-SSOP,是可以采用一对引物扩增所有 HLA-A2 特异性抗原,用 23 个探针和扩增产物杂交,探针用地高辛系统标记和检测,可以鉴定 A2 的 25 个等位基因,并在中国人群 HLA-AO2 等位基因的检测中进行应用,用 B 淋巴母细胞株作为阴性对照,同时与聚合酶链反应-序列特异性引物 (PCR-SSP) 方法比较,结果发现 PCR-SSOP 方法质控好、特异性强、敏感性高、费用低,并在对大样本量进行检测时具有快速可靠等优点。
原理
序列特异性寡核苷酸多态性 PCR 的基本原理:
由于生物种类具有多样性,每一个基因在同一座位上具有多种等位基因。因此可以根据在同一基因上存在的差别将某一生物分为不同的类型,进而在功能上对它们加以区分。序列特异性寡核苷酸多态性 PCR 包括设计通用引物,在不同样品中扩增等位基因;然后,使用多个探针 (同位素标记或生物素等标记) 在特定的条件下进行杂交,探针是针对每一个类型的基因 (同一簇等位基因) 设计的;经过显色或曝光,利用人工或电脑软件判读实验结果。
用途
序列特异性寡核苷酸多态性 PCR 可用于主要组织相容性抗原的分型,常用于对人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)的 A、B、DR 进行分型;还可以检测不同样品间的组织特异性,鉴别分类,并确定亲缘关系;进行基因检验,查找病因,提供精确配型。
材料与仪器
器材:PCR 扩增仪、自动印迹仪。
试剂:
①DNA 抽提试剂:
A. 白细胞裂解液 (white cell lysis buffer, WCLB) 10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6),10 mmol/L EDTA (pH 8.0),50 mmol/L NaCl。
B. 红细胞裂解液 (red cell lysis buffer, RCLB) 10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6),5 mmol/L MgCl2,10 mmol/L NaCl。
C. 酚-氯仿-异戊醇抽提液 (phenol-chloroform-isoamylalcohol, PCI) 酚-氯仿-异戊醇体积比为 25:24:1。
D.10 mg/mL 蛋白酶 K -20℃ 贮存,10%SDS。
②PCR 试剂:
PCR 引物,Taq 酶,Taq 酶缓冲液,dNTP。
③电泳试剂:
上样缓冲液,TBE 缓冲液,溴化乙锭,琼脂糖,DNA 分子量标准。
④DNA 变性剂:
2mol/L NaOH-50 mmol/L EDTA,现用现配。
⑤探针标记试剂:
A.32P 标记探针试剂:
10×多聚核苷酸激酶缓冲液 (0.5mol/L Tris-HCl,pH 7.6,0.1mol/L MgCl2,50 mmol/L DTT),多聚核苷酸激酶,32P 标记的 ATP。
B.Dig-dUTP(digoxigenin-dUTP) 标记探针试剂:
0.05 mmol/L dATP (pH 6.5〜7.5),1nmol/ul Dig-dUTP,末端转移酶,10×末端转移酶缓冲液 (1.4 mmol/L 二甲胂酸钠,300 mmol/L Tris-HCl pH 7.2,25 mmol/L CoCl2),3mol/L 醋酸钠 (pH 6.0~7.0),70% 乙醇,20 mg/ml 糖原。
C.Dig-ddUTP 标记探针试剂:
10×末端转移酶缓冲液 (1.4 mmol/L 二甲胂酸钠,300 mmol/L Tris-HCl pH 7.2,10 mmol/L CoCl2),Dig-ll-ddUTP,末端转移酶 50U/ul。
⑥标记探针的杂交试剂:
A. 杂交缓冲液:
15% 甲醛,10% 50×Denhardt’s 溶液 (10 g 聚蔗糖 Ficoll,10 g 聚乙烯吡咯烷酮,10 g 牛血清白蛋白 V,加 ddH2O 至 1000 ml),5×SSPE(0.15mol/L NaC,0.05mol/L NaH2PO4·7 H2O,5 mmol/L EDTA,pH 7.4),1% SDS,5% 硫酸葡聚糖,0.2 mg/mL ssDNA。
B. 洗涤缓冲液:
3mol/L 四甲基氯化铵 (tetramethylammonium chloride, TMAC),50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0,2 mmol/L EDTA,0.1% SDS。
⑦地高辛标记探针普通检测方法 (不用 TMAC) 试剂:
50×Denhardt's (1% 聚乙烯吡咯烷酮,1% 聚蔗糖,1% BSA) 过滤除菌,-20℃ 贮存。
0.5mol/L EDTA (pH 8.0),20×SSPE (3mol/L NaCl,0.2mol/L NaH2PO4,0.02mol/L EDTA pH 7.4),1% N-十二烷肌酸钠,10% SDS,2mol/L 马来酸,1mol/L MgCl2,1mol/L Tris-HCl (pH 9.5),4mol/L NaCl,4mol/L NaOH,4×缓冲液 1 (0.4mol/L 马来酸,0.6mol/L NaCl,pH 7.5),5% 封闭液 [1000 mL 溶液中含有:0.1mol/L 马来酸,0.15mol/L NaCl,pH 7.5,50 g 封闭液 (Boehringer-Mannheim, Cat#1096-17),65℃ 加热 20 min,分装,4℃ 贮存]。
杂交液:2% 封闭液,6×SSPE,5×Denharts,0.1% N-十二烷肌酸钠,0.02% SDS。
洗涤液:冷洗液 (2×SSPE,0.1% SDS),热洗液 (5×SSPE,0.1% SDS)。
缓冲液 3:(0.1mol/L Tris-HCl,0.1mol/L NaCl,0.05mol/L MgCl2,pH 9.5)。
碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体。
⑧地高辛标记探针化学发光法检测试剂 (用 TMAC):
5 mg/ml 鮭精 DNA(70℃ 加热 1 h 后,振荡 1 min 剪切 DNA),50×Denhardt's 溶液,10% SDS,5mol/L NaCl,TN 缓冲液 (0.1mol/L Tris-HCl pH 7.5,0.,15mol/L NaCl,TNM 缓冲液 (0.1mol/L Tris-HCl pH 9.5,0.1mol/L NaCl,0.05mol/L MgCl2),20×SSPE(3.0mol/L NaCl,0.2mol/L NaH2PO4·7 H2O,20 mmol/L EDTA,pH 7.4),CSPD(50 mL/瓶,Boehringer-Mannheim,Cat#755633),抗地高辛抗体。
杂交液:330 mL 20×SSPE,100 mL 50×Denhardts,1.0 g 肌氨酸,2 mL 10% SDS,20 mL 5 mg/ml 鲑精 DNA,加水至 200 mL。
S/S 洗液 (2×SSPE,0.1% SDS),TMAC 洗液 [500 mL 5mol/L TMA C(sigma,Cat#T- 3411),200 mL dH2O,41.7 mL 1mol/L Tris-HCl pH 7.5,8.3 mL 0.5mol/L EDTA,83.3 mL 10% SDS]。
步骤
(一)流程一
(二)流程二
(三)流程三
(四)流程四
(五)流程五
引物 | 10pmol | [γ-32P] ATP | 15uCi |
10×多核苷酸激酶缓冲液 | 1.5ul | 加 H2O 至 | 15ul |
T4 多核苷酸激酶 | 5U |
5×末端转移酶缓冲液 | 24ul | digoxigen-dUTP | 10.5ul |
末端转移酶 | 3ul (75U) | SSOP 引物 | 4ul (300pmol) |
25 mmol/L CoCl2 | 6.3ul | 加 H2O 至 | 120ul |
0.05 mmol/L dATP | 10.5ul |
SSOP 引物 | 40pmol | 25 mmol/L CoCl2 | 6ul |
5×末端转移酶缓冲液 | 24ul | dig-11-ddUTP(1nmol/ul) | 4ul |
末端转移酶 | 2ul(100U) | 加入 dH2O | 44ul |
(六)流程六
(七)流程七
(八)流程八
将 TMAC 废液存放在一个有利于环保的容器中。
注意事项
1.DNA 样品制备
制备高质量的 DNA 样品对于 PCR-SSOP 是至关重要的。如果使用全血应在抽取样品后 2〜3d 内提取 DNA,样品应放在室温下保存。如果不能立即抽提,应将样品放在-70〜-20°C。全血样品冰冻后可放置一年时间。
2.PCR 反应
选择引物要根据具体情况和相关资料来设计;扩增时的反应条件也要根据具体情况而定,不能一概而论。
3. 杂交、洗涤和检测
在杂交过程中杂交的温度取决于探针,不同的探针冗值不同,杂交所需温度不同。
在杂交中必须设立阴性和阳性对照,在显影的过程中,注意阴性和阳性的变化,每隔 10 min 要观察一次,保证阴性对照不显色或颜色很淡。
另外假阴性有可能是由于每个点上的 DNA 量太少的缘故造成的,这就需要 PCR 扩增时要达到一定的量。另外探针的质量、杂交的温度都有可能影响结果的判定。需要在实验过程中不断地摸索适宜条件。
4. 设立对照
(1)检测扩增 DNA 污染时的对照
检测 DNA 污染的阴性对照是在扩增 DNA 时除不加模板之外的其它条件均与扩增的条件一致,杂交时也要用相同的引物,这样可以检测到由于外源 DNA 的污染带来的假阳性现象。
(2)扩增特异性的对照
高质量的 DNA 才能用来杂交检测。在实验过程中必须设立一个阴性对照以检测扩增的特异性,对照模板 DNA 应不具有被检测 DNA 的等位基因,但必须是基因组 DNA,因为克隆的片段不能真实反映对照的特异性。在杂交时同样用相同的探针来鉴别扩增的特异性。所有的 PCR 产物都必须进行凝胶电泳检测以确定产物的大小和质量。
(3)探针特异性对照
阳性对照 DNA 必须携带能和每一个探针杂交的已知等位基因。如果可能,推荐使用的参照细胞应具有纯合的待检测座位,这样可以简化杂交过程中的影响因素。每个探针都应该设置一个不包括该等位基因的阴性对照。如果一个给定的 SSOP 仅有一个核甘酸与特定序列错配,那么阴性对照细胞也应该包括这一特殊序列。每一次杂交都应该包括这些对照来指导探针的特异性,而杂交的底物应是制备的基因组 DNA。
(4)DNA 定量对照
对于同一探针杂交的样品,每一张膜上都要设置变性 DNA 的定量对照。
(5)设置阳性检测对照
加入阳性对照能够检测系统是否正常工作,例如用随机加入标记地高辛的 dUTP 的 DNA 作为检测 DNA,此样品可以和抗地高辛抗体直接反应产生阳性信号。
来源:丁香实验