采用流式细胞术评估淋巴细胞介导的细胞毒作用

采用流式细胞术评估淋巴细胞介导的细胞毒作用，是一个非放射性的以单个细胞为基础的实验，可以研究 CTL 介导的对不同谱系的原代靶细胞的杀伤，检测靶细胞和效应细胞的表型和归宿，阐明细胞毒性淋巴细胞的生物学功能。

采用流式细胞术评估淋巴细胞介导的细胞毒作用的基本原理是利用能通透细胞的荧光源性 caspase 底物和多参数的流式细胞术来检测靶细胞中的 caspase 的活化，并用这些手段来量化和显示细胞毒性淋巴细胞的活性。

器材：FACSCalibur 流式细胞仪。

试剂： 红细胞裂解液、完全培养液、台盼蓝。

采用流式细胞术评估淋巴细胞介导的细胞毒作用的实验步骤如下：

（一）靶细胞的准备：

A. 用 RPMI 1640 完全培养液把靶细胞重悬 T 15 mL 尖底管。

B. 用台盼蓝拒染法计数活细胞。调节细胞浓度到 2×106/mL。

C. 加入 0.5 mL 靶细胞到 FACS 管作为 A 管。把 A 管放在冰上直至上流式细胞仪采样。

D. 加入 0.5 mL 靶细胞到 15 mL 尖底管作为 B 管。加入凋亡诱导剂如星抱霉素 (staurosporine) 诱导细胞凋亡，终浓度 1uM。37℃，5% CO₂ 孵育，3-5 h。(B 管作为流式设置 FL1 通道的对照)。

E. 把剩余的靶细胞悬液分为两份放入 15 mL 尖底管 (管 a 和 b)。把 CTO/TFL2 按终浓度 1.5uM 加入试管中。在管 a 加入终浓度为的抗原肽，管 b 中加入无关对照肽。

F. 管 a 和管 b 瓶盖旋松后 37℃，5% CO₂ 孵育 l h，这段时间内准备效应细胞。

G. 靶细胞孵育 l h 后，用 10 倍体积完全 RPMI 1640 至少洗 1 次。

H. 用完全 RPMI 1640 重悬细胞 2×106/mL。把细胞放在冰上，直至效应细胞准备好。

I. 从管 a 和管 b 中各取 0.5 ml 细胞放入 FACS 管 (C 管和 D 管)。C 管放在冰上至釆样 (此管用于设置流式 FL-2 通道对照)，D 管放在冰上 (此管用于检测靶细胞凋亡的基础量)。

（二）来源于脾或淋巴结的效应细胞的准备

A. 收集病毒感染后 5-8d 的脾和淋巴结。

B. 把 1 个 70uM 细胞滤网放在 50 mL 管上，把新鲜取出的器官放入细胞滤网中。

C. 用 3 mL 注射器栓研磨组织，直至剩下大部分为纤维组织。

D. 用 20 mL 完全 RPMI 1 640 培养液冲洗滤网上细胞，弃去滤网。

E.250 g 离心 l0 min, 弃上清。

F. 把脾细胞用 RBC 裂解液重悬（5 mL/脾用以去除红细胞），室温孵育 5 min，加满 RPMI 1 640，250 g 离心 l0 min, 弃上清。

G. 用适量的 RPMI 1 640 重悬细胞, 胎盘蓝拒染法计数活细胞。

H. 调节细胞浓度至 5x107/mL。

（三）用 Caspase 底物检测靶细胞的凋亡

A. 根据 E/T 比例把效应细胞做一系列稀释加入 96 孔圆底板。用一个多通道加样器把 A 行的细胞悬液转入 100 叫/孔到 B 行相应的孔中。混合 3-5 次。换吸头，把 B 行的细胞悬液按 100ul 烫/孔转移到 C 行。

B. 在 96 孔板中加入 100ul/孔靶细胞悬液（2 x 105/孔）。把靶细胞和效应细胞吹吸混匀。

C. 把管 D 中的靶细胞加 200ul 到 96 孔板的一个孔中。

D. 把培养板放到 37℃，5% CO₂ 孵育 1-3 h。

E. 把培养板和管 B 250 g 离心，轻甩培养板和真空抽吸试管，去除上清

F. 每个样品中加入 75ul caspase 底物 PhiPhiLux-GlD2, 轻轻混匀。从本步骤开始不要振荡混合样品，以免凋亡细胞破碎。

G.37℃，5% CO₂ 孵育 30 min。

H. 每个样品加入冰预冷的缓冲液洗涤细胞 2 次。

I. 洗涤后用洗涤缓冲液重悬细胞，每样品加 300ul。

J. 把细胞转入 FACS 管。把星孢霉素处理过的靶细胞标记为 B 管。

（四）流式细胞仪分析

A. 用 A 管（未标记靶细胞）设置 FL-1 和 FL-2 的初始值，使大部分 events 的荧光强度位于，每个轴的 100-101。

B. 用 B 管（PhiPhiLux-G1D2 标记的凋亡靶细胞）设置 FL-2 通道的补偿。

C. 用 C 管（CT0/TFI2 标记靶细胞）设置 FL-1 通道的补偿。

D. 收集剩余样品。

（五）细胞毒活性的检测

A. 用 CellQuest，FlowJo 或 WinMDI 软件分析数据，获取不同细胞群的象限统计值。