过氧化氢酶（CAT ）活性的测定

植物在衰老或者遭受逆境时，体内活性氧代谢加强因而累积H2O2，从而使细胞遭受损伤。过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，可以清除H2O2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中过氧化氢酶活性与植物的代谢强度及抗逆性密切相关。 掌握紫外吸收法测定过氧化氢酶活性的原理和方法。

在240 nm波长下有强吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240）随反应时间延长而降低。根据测量吸光度的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

材料：植物叶片。

试剂： 1 mol · H₂O₂：30% H₂O₂ 大约等于 17.6 mol・L ，

取 30% H₂O₂ 溶液 5.68 mL,稀释至1 000 mL；

0.2 mol · L^-1 pH 7.8磷酸缓冲液（内含1% 聚乙烯毗咯烷酮）。

器材：紫外分光光度计，恒温水浴锅，离心机，研钵，0.5 mL刻度吸管，10 mL试管。

过氧化氢酶（CAT）活性的测定的基本过程可分为如下几步：

1. 酶液提取：称取小麦叶片1.0 g加入pH 7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至10 mL刻度试管中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入刻度试管中，用同一缓冲液定容，4 000 r · min^-1离心15 min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

测定：取10 mL试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管（将酶液煮死），按表 40-1顺序加入试剂。

25°C预热后，逐管加入0.3 mL 0. 1 mol · L^-1的H₂O_2，每加完1管立即计时，并迅速倒入石英比色杯中，240 nm下测定吸光度，每隔1 min读数1次，共测4 min，待3支管全部测定 完后,计算酶活性。

结果计算：以1 min内 A₂₄₀ 减少0.1的酶量为1个酶活单位（U）。

式中：A₂₄₀=Aso—（Asi+As₂ )/2（Aso 为加入煮死酶液的对照管吸光度，A_S1、A_S2为样品管吸光度）；

V_t一粗酶提取液总体积，mL

V_1一测定用粗酶液体积，mL,

FW一样品鲜重，g；

0.1一 A₂₄₀ 每下降0.1为1个酶活单位，U；

t一加过氧化氢到最后一次读数时间，min。

凡在240 nm下有强吸收的物质对本实验都有干扰。