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过氧化氢酶(CAT )活性的测定

相关实验:过氧化氢酶(CAT)活性的测定

最新修订时间:

简介

植物在衰老或者遭受逆境时,体内活性氧代谢加强因而累积H2O2,从而使细胞遭受损伤。过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中,可以清除H2O2,是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此,植物组织中过氧化氢酶活性与植物的代谢强度及抗逆性密切相关。 掌握紫外吸收法测定过氧化氢酶活性的原理和方法。

原理

在240 nm波长下有强吸收,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间延长而降低。根据测量吸光度的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

材料与仪器

材料:植物叶片。

试剂: 1 mol · H2O2:30% H2O2 大约等于 17.6 mol・L ,

取 30% H2O2 溶液 5.68 mL,稀释至1 000 mL;

0.2 mol · L-1 pH 7.8磷酸缓冲液(内含1% 聚乙烯毗咯烷酮)。

器材:紫外分光光度计,恒温水浴锅,离心机,研钵,0.5 mL刻度吸管,10 mL试管。

步骤

过氧化氢酶(CAT)活性的测定的基本过程可分为如下几步:

1. 酶液提取:称取小麦叶片1.0 g加入pH 7.8的磷酸缓冲溶液少量,研磨成匀浆,转移至10 mL刻度试管中,用该缓冲液冲洗研钵,并将冲洗液转入刻度试管中,用同一缓冲液定容,4 000 r · min-1离心15 min,上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

测定:取10 mL试管3支,其中2支为样品测定管,1支为空白管(将酶液煮死),按表 40-1顺序加入试剂。

25°C预热后,逐管加入0.3 mL 0. 1 mol · L-1的H2O2,每加完1管立即计时,并迅速倒入石英比色杯中,240 nm下测定吸光度,每隔1 min读数1次,共测4 min,待3支管全部测定 完后,计算酶活性。

结果计算:以1 min内 A240 减少0.1的酶量为1个酶活单位(U)。

式中:A240=Aso—(Asi+As2 )/2(Aso 为加入煮死酶液的对照管吸光度,AS1、AS2为样品管吸光度);

Vt一粗酶提取液总体积,mL

V1一测定用粗酶液体积,mL,

FW一样品鲜重,g;

0.1一 A240 每下降0.1为1个酶活单位,U;

t一加过氧化氢到最后一次读数时间,min。

注意事项

凡在240 nm下有强吸收的物质对本实验都有干扰。

来源:丁香实验

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