苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的测定

相关专题

一、原理

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonialyase，PAL）催化苯丙氨酸的脱氨反应，使NH3释放出来形成反式肉桂酸。此酶的在植物 体内次生物质（如木质素等）代谢中起重要作用。根据其产物，反式肉桂酸在290nm处吸光度的变化可以测定该酶的活性。

二、材料、仪器设备 及试剂
（一）材料：马铃薯块茎

（二）仪器设备：1. 紫外分光光度计 ；2. 离心机；3. 研钵；4. 吸滤瓶；5. 红光装置；6. 打孔器。

（三）试剂：1. 0.05mol/L 硼酸盐缓冲溶液（pH8.8）；2. 0.02mol/L 苯丙氨酸（用0.1mol/L pH8.8硼酸缓冲液配制）；3. 5mmol/L 巯基乙醇硼酸缓冲液。

三、实验步骤

1. 马铃薯圆片制备　将马铃薯块茎洗净、削皮，用打孔器（直径1.5cm）取圆柱，切除两头近表皮处，中间部分切成2mm厚的圆片。先用自来水漂洗，最后用蒸馏水洗一次，用纱布吸干表面的水。

2. 光诱导　将圆片平铺在湿润滤纸的培养皿中，置20～30℃红光下处理24h以诱导PAL（也可接种病原菌诱导等）。

3. 酶粗提液的制备　经诱导处理的马铃薯圆片5g，加10ml含5mmol/L 的巯基乙醇的硼酸缓冲液、0.5g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或PolyclarAT（除去酚类物质毒害，防止颜色的干扰、少量石英砂在研钵中研磨。匀浆抽气过滤，滤液10，000rpm离心15min，上清液为酶粗提液。上述操作均在0～4℃下进行。

4. 活性测定与计算　1ml酶液加1ml0.02mol/L 苯丙氨酸，2ml蒸馏水，总体积为4ml。对照不加底物，多加1ml蒸馏水；反应液置恒温水浴30℃中保温，0.5h后用紫外分光光度计在290nm处测定吸光度。以每小时在290nm处吸光度变化0.01所需酶量为一单位（相当每毫升反应混合物形成1μg肉桂酸）。蛋白质含量用Folin－酚法进行测定。