LAK细胞和TIL活性的测定
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LAK细胞和TIL活性的测定基本同NK活性测定方法。但所用靶细胞为对NK不敏感的肿瘤细胞,如Raji、Daudi或自体肿瘤细胞。常采用同位素法如51 Cr释放试验、发光免疫测定法及MTT比色法等。 在此介绍MTT比色法。
试剂及材料
1. 试剂:①四甲基偶氮盐(MTT);②酸化异丙醇:含0.04mol/L HCl的异丙醇;③96孔细胞培养板。
2. 肿瘤细胞系: Raji细胞、Daudi细胞为B细胞性白血病细胞株;Molt-4为T细胞性白血病细胞,对LAK细胞敏感,而对NK细胞毒作用不敏感;K562为红白血病细胞株,对NK细胞毒作用敏感。所有细胞株均培养在含10%~20%NCS的RPMI-1640完全培养液中,取对数生长期细胞经不完全工作培养液洗涤,台盼蓝染色计数,以含20%NCS的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至2×106 /ml备用。
操作方法
1. 按上述方法分离LAK细胞或TIL,用含IL-2的20%NCS-RPMI-1640调整LAK细胞或TIL浓度至1.5x106 /ml;
2. LAK细胞或TIL与不同的白血病细胞株按效靶为1:1~20的比例分别取100μl接种于96孔平底培养板内共同培养,每个试验做三个复孔。设不同浓度效应细胞200μl/孔单独培养测定效应细胞的吸光度。同时将不同的白血病细胞株分别用20%NCS-RPMI-1640培养液调整至3×104~1×105 /ml,取100μl细胞悬液和100μl培养液接种于96孔培养板中,每个浓度接种3复孔,以测定不同浓度肿瘤细胞的吸光度;
3. 将上述接种好的细胞培养板置37℃,CO2 温箱孵育20h;
4. 于终止培养前,每孔加入MTT 10μl,混匀后再培养4~6h;
5. 吸弃上清液,每孔加入溶剂(DMSO)100μl,稍振荡待产物充分溶解;
6. 在酶标仪上,测定OD560nm ;
结果分析
细胞毒性百分率按下列公式计算:
ODE+T=效应细胞孔OD值+靶细胞孔OD值
ODE=相应浓度单独效应细胞的OD值
ODT=相应浓度单独靶细胞的OD值