简介
苯丙氨酸解氨酶（PAD 对植物体的木质素、植保素、类黄酮、花青素等次生物质 的形成起重要的调节作用，且与植物的抗病作用有一定的关系。本实验了解测定苯丙氨酸解 氨酶活性的原理和方法。
原理
苯丙胺酸解氨酶（PAL）活性的测定的基本原理是苯丙氨酸解氨酶是植物次生代谢中的一个关键酶。它催化 L-苯丙氨酸的脱氨 反应. 释放氨而形成反式肉桂酸。根据产物反式肉桂酸在波长 290 nm 处吸光度的变化，可以 测定该酶的活性。
材料与仪器
材料：黄化水稻幼苗。
器材：冷冻高速离心机，紫外-可见分光光度计，旋涡混合器，恒温水浴锅等。
试剂：
①0. 1 mol ・L-1硼酸缓冲液（pH 8. 8）
②0. 02 mol ・ L-1 L-苯丙氨酸：称取 3.33 g L-苯丙氨酸溶于 1 000 mL 0. 1 mol・L-1 硼酸缓冲液（pH 8. 8）
③7 mmol - 巯基乙醇硼酸缓冲液：0. 11 mL 藐基乙醇用 0. 1 mol・L-1 硼酸缓冲液溶解，并定容至 200 mL
④聚乙烯毗咯烷酮（PVP）
步骤
苯丙胺酸解氨酶（PAL）活性的测定的基本过程可分为如下几步：
1. 酶液制备：称取黄化水稻幼苗 0.5 g, 先加 1.5 mL 预冷的提取液（即 7 mmol ・ L-1 蔬基乙醇硼酸缓冲液）、过量的聚乙烯毗咯烷酮（PVPX）（但不能太多，否则不易研磨）、少量石英砂在冰浴下研磨成浆，再加 3.5 mL 预冷的提取液使其终体积为 5 mL。于 12 000 g 4°C 下离心 15 min, 用吸管吸取上清液，即粗酶液。
2. 酶活测定：
反应液包括：①0.02 mol・ L-1 L-苯丙氨酸 1 mL；
②0.1 mol ・L -1 硼酸缓冲液（pH 8. 8）2 mL；
③0.1 mL 粗酶液。
（对照以 0. 1 mL 疏基乙醇缓冲液代替酶液）
反应液用涡旋混合器混匀后立即在 290 nm 处测起始吸光度值，并精确计时。（每一样品 重复两组）将测定后的各管于 30°C 水浴保温 30 min, 再于 290 nm 处测定各管的吸光度值。 本实验以每 30 min 在波长 290 nm 处吸光度值增加 0. 01 所需酶量为 1 个单位（U）。
苯丙氨酸解氨酶活性（U - g -1鲜重）= 
式中 a —测定时的酶液用量，mL；
V—酶液总体积，mL；
W—样品重，g。
（苯丙氨酸解氨酶活性也可以 U • mg-1 蛋白表示. 蛋白质含量可用考马斯亮蓝 G-250 法测定，以牛血清白蛋白作标准）。
注意事项
要求分光光度计有准确的波长。
来源：丁香实验
