抗坏血酸过氧化物酶 (AsA-POD)活性的测定

了解抗坏血酸过氧化物酶 (AsA-POD) 的作用。掌握分光光度法测定抗坏血酸过氧化物酶活性的方法。

抗坏血酸过氧化物酶 (AsA-POD)活性的测定的基本原理是AsA-POD 催化 AsA 与 H₂O₂ 反应，使 AsA 氧化成单脱氢抗坏血酸 (MDAsA)。 随着 AsA 被氧化，溶液中 290 nm 波长下的消光值 (A₂₉₀) 下降，根据单位时间内A₂₉₀减少值, 计算 AsA-POD 活性。AsA 氧化量按消光系数 2.8(mmol・L^-1・cm^-1) 计算，酶活性可用每克鲜重每小时氧化 AsA 的物质的量 (μmol ・g^-1・h^-1) 表示。

材料：新鲜果实、蔬菜，植物根、茎、叶等。

器材：离心机，紫外分光光度计，研钵，试管等。

试剂：

①K₂ HPO₄-KH₂PO₄ 缓冲液 (pH7. 0, 内含 0. 1 mmol ・ L-1 EDTA-Na₂ )

②0. 3 mmol • L ^-1 AsA

③20 μmol • L ^-1 AsA

④0.06 mmol • L^-1 H₂O₂

1. 酶液制备：取 1.0 g 植物叶片剪碎，按 1 ： 3(W/V) 加入预冷的 50 mmol・L1 K₂ HPO₄-KH₂PO₄ 缓冲液进行研磨提取，用两层纱布过滤，滤液在 4 000 r • min'1 下离心 10 min, 上清液作酶粗提液供测定。

2. 酶活性测定：3 mL 反应混合液中含 50 mmol • L^-1, K₂ HPO₄-KH₂PO₄ 缓冲液 (pH7.0),0.l mmol • L^-1 EDTA-Na_2， 0. 3 mmol • L^-1 AsA, 0. 06 mmol • L^-1 H₂O₂ 和 0. 1 mL 酶液。加入 H₂O₂ 后立即在 20°C 下测定 10〜30 s 内的 A290 变化，计算单位时间内 AsA 减少量及酶活性，以 1 min 内人 29。减少 0.01 的酶量为 1 个酶活单位 (U)。

抗坏血酸过氧化物酶活力 [U・(g・ min)t] = WUoTl X t
式中:AA₂₉₀——反应时间内吸光度的变化；
Vt—粗酶提取液总体积，mL；
V₁一测定用粗酶液体积，mL；
FW—样品鲜重,g；
0. 01—A₂₉₀ 每下降 0. 01 为 1 个酶活单位 (U)；
t 一反应时间，min。

1. 酶液的提取过程要尽量在低温条件下进行。

2.要在反应开始前加入，不能直接加入。