腹泻病毒的分离与鉴定

病毒分离虽然在某些情况下可以成功使用，但并非检测腹泻病毒的常规方法。因为，任何一种人杯状病毒在细胞培养中都无法生长，而且其他的腹泻病毒也对生长条件比较挑剔。

有几种不同的细胞系（例如：MA104，CaCo-2，原代猴肾细胞）可用于粪便标本中A组轮状病毒的分离，但是成功的分离通常需要经过一系列的复杂过程。相对于粪便标本，用直肠拭子进行病毒分离不太可能产生阳性的培养结果。

已有不同的方法用于腹泻病毒的检测和分型。这些方法可以直接对临床标本进行检测；使用细胞系从临床标本中分离出病毒时，相同的方法也适用于病毒分离物的检测。现有抗原分型和基因分型两种方法对病毒进行鉴定，对于那些能在细胞培养基中生长的病毒，可以使用型特异性抗血清以交叉中和试验的反应性结果来判断血清型。

器材：
①一次性无菌手套
②培养箱、离心机

试剂：
①培养基
②抗生素

腹泻病毒的分离与鉴定根据病毒种类不同具体如下：

1．病毒分离

（1）肠道腺病毒（腺病毒40型和41型）首先在Chang氏结膜细胞（Chang conjunctival cells）中被分离出来，然而现在许多病毒学家使用Graham293细胞分离这些病毒。这些病毒在细胞培养中通常很少或者不引起细胞病变效应，比其他人腺病毒更难分离。

（2）星状病毒可以在不同的细胞系中进行培养，以来源于人小肠组织的细胞系（CaCo-2、T84细胞）最为敏感。可以用载玻片培养法（shell vial assay）快速检测出阳性的培养物。该方法是在孵育18小时后，用免疫荧光法在培养细胞中检测病毒抗原。使用细胞对病毒进行分离扩增之后再用RT-PCR技术检测，是另一种用于识别星状病毒的方法。

2．病毒的鉴定

（1）轮状病毒的鉴定：A组轮状病毒可以分为G血清型（根据糖蛋白VP7划分）和P血清型（根据对蛋白酶敏感的VP4划分）。已经开发出了检测G和P血清型的单克隆抗体，但是单克隆抗体还没有在临床实验室中广泛应用。

临床实验室应用广泛的是基于RT-PCR的检测方法，这种方法采用型特异性引物可以进行基因分型分析。由于新毒株的不断出现或者引物设计区域发生核苷酸点突变，PCR方法有时不能对病毒株进行基因分型或者导致错误分型。根据对11个基因片段逐个进行核苷酸序列分析，已经开发出了一个完整的基因分型系统用于病毒株的分类，这种方法可以检出轮状病毒重组株和新出现的病毒株。

（2）杯状病毒的鉴定：由于在体外无法培养人杯状病毒，因此很难建立杯状病毒血清型分型方法。使用固相免疫电镜（solid-phase immune electron microscopy，SPIEM）检测人恢复期血清标本中的诺如病毒，可以对诺如病毒进行抗原分型，但是由于这些检测缺少标准试剂，这项技术在大多数实验室并不实用。

分子生物学方法可以将诺如病毒和札如病毒分成若干基因组和基因型，基因组和基因型的确定是根据全长VP1区的核苷酸序列的差异，但是较短的基因组序列也可用来推测基因型。虽然可利用聚合酶基因的核苷酸序列差异来对诺如病毒进行基因分型，但当病毒发生重组时会导致错误的基因分型。

因此，同时获得聚合酶和衣壳的核苷酸序列，不仅可以确定基因分型，还能识别重组的病毒株。基因组特异的RT-PCR技术也可以用来检测病毒的基因组，当扩增产物无法测序时可以用杂交方法推测基因型。对札如病毒进行分类的检测方法目前还很少，曾有报道关于基因组特异性的RT-PCR技术对札如病毒进行分类。

（3）肠道腺病毒的鉴定：肠道腺病毒可以按照其抗原性分类或者按照基因型分类。人腺病毒可以根据它们凝集大鼠和猴红细胞的能力进行分类，肠腺病毒F组与C组和E组的特性相同，可以部分地凝集大鼠红细胞。

在六邻体（hexon）蛋白和纤毛（fiber）蛋白上还发现了组和型特异性的抗原决定簇，而且识别这些抗原决定簇的单克隆抗体可以用于腺病毒分类。肠道腺病毒的基因分型还可以通过斑点杂交法、基因组DNA的限制性酶切片段长度多态性分析（RFLP）或者型特异性的PCR法鉴定。

（4）星状病毒的鉴定：用型特异性抗血清可将星状病毒分成不同的血清型，这种检测可以通过ELISA法进行。除此之外，星状病毒还可以用分子生物学方法进行分类。

对于鉴定对应于血清型的基因型，通过对RT-PCR扩增后的产物进行核苷酸序列分析来确定，这种方法中使用的引物需能够扩增所有星状病毒株；基因型还可以使用型特异性引物的RT-PCR技术，根据PCR扩增产物的大小来确定，这种方法中使用的引物根据不同基因型病毒扩增后产生不同大小的扩增片段来确定。