PCR-单链构象多态性

PCR-单链构象多态性是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。

PCR-单链构象多态性的基本原理是在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。

PCR产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶DNA中含单碱基置换，或数个碱基插入或缺失等改变时，因迁移率变化会出现泳动变位，从而可将变异DNA与正常DNA区分开。

由此可见，PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。

器材：PCR仪、电泳仪、放射自显影仪

试剂：

1. PCR反应试剂
Taq DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、缓冲液、[γ-32P] ATP和[α-32P] dCTP、引物和dNTP。
2.电泳试剂
①丙烯酰胺亚甲基丙烯酰胺(49:1)，去离子甲酰胺，甘油。
②上样缓冲液: 95 % 甲酰胺，20 mmol/L EDTA pH8.0, 0.05% 二甲苯腈，0.05% 溴酚蓝。
③TAE缓冲液或TBE缓冲液。
3.放射自显影及染色试剂
①放射自显影X感光片。
②EB染色: 0.5 μg/ml EB。
③银染法试剂:甲醇，乙酸，戊二醛，AgNO₃，Na₂CO₃, 甲醛，柠檬酸。

PCR-单链构象多态性的基本过程可分为如下几步：

（一）PCR扩增基因

(1)无同位素标记的PCR反应PCR 反应体系: 10×PCR缓冲液5 μl，dNTP混合物4 μl(2.5 mmol/L)，引物11 μl (终浓度0.2~1.0 μmol/L)，引物21 μl (终浓度0.2~1.0 μmol/L)，Taq酶0.1 ul (5 U/μl)，模板DNA 1 μl (<1 pg)， 加ddH₂O至50 μl。
根据引物和所扩增基因的特性确定循环反应参数，循环30次。
扩增产物经PCR回收试剂盒纯化后，4 ℃贮存备用。
(2) [γ-32P] ATP同位素标记的PCR反应
①PCR引物标记：
10× T4多聚核苷酸激酶缓冲液 2 μl
引物1(10 μmol/L) 1 μl
引物2(10 μmol/L) 1 μl
[γ-32P] ATP(5000 Ci/ mmol) 4 μl
T4多聚核苷酸激酶(5 U/μl) 4 μl
ddH₂O至 20 μl

37 ℃温浴30 min, 75 ℃ 2 min 终止反应，4 ℃贮存备用。
②PCR反应(用标记的引物)
反应体系：
10×PCR缓冲液 2 μl
引物1 (4~20~1.0 μmoI/L) 1 μl
引物2 (4~20~1.0 μmoI/L) 1 μl
dNTPs(2.5 mmol/L) 4 μl
Taq酶(5 U/μl) 0.1 μl
模板DNA (<1 μg/μl) 1 μl
ddH₂O至 20 μl
进行PCR扩增。
产物经回收试剂盒纯化后，4 ℃贮存备用。
(3) [α-32P] dCTP 同位素标记的PCR反应
反应体系:
10×PCR缓冲液 8 μl
引物1 (4~20~1.0 μmoI/L) 1 μl
引物2 (4~20~1.0 μmoI/L) 1 μl
dNTPs(2.5 mmol/L) 4 μl
[α-32P] dCTP(3000 Ci/ mmol) 2 μl
Taq酶(5 U/μl) 0.2 μl
模板DNA (<1μg/μl) 1 μl
ddH₂O至 80 μl
进行PCR扩增。
产物经回收试剂盒纯化后，4 ℃贮存备用。

（二）PCR样品的变性处理

(1)碱变性法：取PCR产物12 μl 加入0.5 mol/L的NaOH 1 μl和20 mmol/L的EDTA 1 μl，混匀，于42 ℃变性5 min，之后加人上样缓冲液。
(2)热SDS变性法：取PCR产物1μl,加入0.2% 的SDS溶液1 μl、20 mmol/L 的EDTA 1 μl， 混匀，沸水浴3~5 min后立即放至冰浴中骤冷3~5 min，迅速离心片刻，仍置于冰上。

（三）制备聚丙烯酰胺凝胶

制备聚丙烯酰胺凝胶进行常规电泳。

（四）凝胶的显色或显影

(1) X光片显影

电泳结束后将两块玻璃板小心分开，使凝胶与其中一块玻璃板相贴。剪一张与凝胶大小相等的滤纸平铺在凝胶表面，小心地将玻璃板拿掉。将滤纸和凝胶一起放入X光片暗盒中，滤纸朝下，凝胶面朝上。将凝胶和滤纸包上保鲜膜，然后将胶片放在保鲜膜之上，在胶片上加上增感屏。将暗盒放在-70 ℃进行放射自显影36~72 h,用显影液和定影液显影。

(2) EB染色

电泳结束后，将凝胶从玻璃板上轻轻取下，浸入由缓冲液配制的0.5μg/ml的 EB染色液中，室温染色30~45 min,用水轻轻冲洗。然后在紫外检测仪上观察照相。

(3) 银染法显色 下面简单介绍两种方法。

①小心揭开玻璃板并使凝胶黏附于一块玻璃板，放入10% 的乙酸和50% 的甲酸中浸泡 30 min,并缓慢摇动。然后将凝胶和玻璃板转至7% 的乙酸和50% 甲醇中浸泡30 min。最后转至 10% 戊二醛中浸泡30 min,轻轻晃动，使样品充分固定。用蒸馅水洗去多余的固定液。将凝胶在 0.1% AgNO₃液中浸泡30 min,轻轻摇动，使凝胶上的银粒分布均匀。

将凝胶放入显色盘中，加 入100 ml 30% Na₂CO₃ (内含10 μl37% 的甲醛)，50 ℃温浴显色，轻轻摇动显色盘，使凝胶上样 品带的银粒还原均匀，数分钟内可出现染色带，继续温浴至电泳带清晰为止。加入5 ml 2.3 mol/L 柠檬酸缓冲液终止，用蒸馏水冲洗几次，照相。

②将凝胶放入50% 的甲醇和12% 的乙酸溶液中10 min,之后放10%的甲醇和5% 的 乙酸中10 min，再放入0. 0034mol/L的重铬酸钾和0. 0032 mol/L的硝酸溶液中反应5 min。在0. 012 mol/L的硝酸银溶液中放置20 min,用0. 28 mol/L的碳酸钠和0. 5 ml/L甲醛显色5 min左右，在光照条件下用1% 的乙酸终止反应。注意在完成每一步操作后都要用去离子水冲洗凝胶。

(4) 结果分析
PCR样品经变性和电泳后，单链条带不一定只有两条，由于单链构象的多 样性和中间结构的存在，可以出现多条单链带，但不同的样品DNA片段的单链带的颜色深浅是 一致的。代表基因变异的泳动变位不一定表现在两条单链带上，应根据实验中的对照样品确立单 链和双链的位置，从而检测出变异DNA的泳动变位。

采用PCR-SSCP检测DNA样品的点突变, 不能排除假阳性，不能用此种方法检测的突变，可通过改变实验条件或检测方法来达到目的，最 终筛选的泳动变位，即可确定该DNA片段有突变发生。

1. PCR扩增片段的长度

PCR-SSCP在用于检测点突变时，对于PCR扩增片段的长度要求较高。在扩增片段小于 400 bp时，通过凝胶电泳分离单链的效果较好。扩增片段在200 bp左右时，PCR-SSCP能检 测90% 以上的单个碱基替换，扩增片段在400 bp时能检测出80% 左右的单碱基替换。在扩增片段较长时，可釆用限制性内切酶酶解后，再进行PCR-SSCP分析，这样可得到较理想的分析结果。

2. PCR样品及产物的处理

扩增用的样品DNA的纯度要比较高，OD260 /OD280 >1.6以上，如达不到应进行纯化。PCR 扩增的条带特异性要求也比较高；可以通过对引物的分析来选择特异性引物，或改变PCR退火 温度、时间等条件达到特异性扩增的目的。PCR产物最好进行纯化后再上样，这样可以避免引 物、dNTP等造成的影响。PCR产物必须进行合理的稀释（1 ：4或1：6等），避免高浓度的 DNA发生复性使单链条带模糊不清。

3. 电泳前的准备

PCR-SSCP凝胶厚度不要超过0.4 mm,样品上样前要仔细冲洗点样孔。在灌胶前注意凝胶一定要混匀，凝胶板要洗净，灌胶要迅速。配制的电泳缓冲液母液最好不要超过一个月，每次电泳 要更换新稀释的缓冲液。这样可以减少微笑形带或波浪形带。

4. 凝胶的浓度及交联度

不同浓度的凝胶有着各自的有效分离范围，5% 丙烯酰胺的有效分离范围在80~500 bp, 8% 丙烯酰胺的有效分离范围在60~400 bp, 12%丙烯酰胺的有效分离范围在40~200 bp。常用的凝 胶的浓度一般在5% ~8% ,要根据自己的实际情况决定凝胶的浓度，从而达到理想的分离效果。

交联度可用亚甲基双丙烯酰胺占整个丙烯酰胺单体的浓度的百分比来表示。低交联度的凝胶 有利于DNA互补链的分离。百分比越大，凝胶的硬度越高，凝胶的孔径越小；反之，百分比越 小，凝胶越软，孔径越大，对DNA的构型就更敏感。

在SSCP分析中凝胶的交联度通常在1% ~2% 。丙烯酰胺与亚甲基双丙烯酰胺的比为49 ：1。

5. 甘油的浓度
低浓度的甘油（5% ~10% ）能够提高分离突变序列的效率。因为甘油对核酸来说是一种弱 变性剂，它能部分打开DNA单链的折叠结构，从而使DNA分子暴露的表面积增加，进而增加 凝胶对突变引起的结构差异进行定位的机会。

通常在20~25 ℃时，加入甘油会得到满意的电泳 结果。但由于甘油的黏度较大，在4 ℃电泳时，黏度更大，因而降低了分子的迁移率。由于目的 基因的序列不同，在4~10 ℃电泳时，无甘油的条件下电泳的结果较好。然而对有些DNA片段 的分离在无甘油存在的凝胶中，突变序列引起的泳动变位是比较少见的。值得注意的是有极少量 的突变只能在25 ℃、无甘油的特定条件下才能检测到。

6. 温度
在凝胶电泳期间，凝胶板的温度会随着电泳时间的延长而增加，这对于有效地分离突变的DNA十分不利。因此在实验时一定要采取措施来控制凝胶板的温度。釆取风冷或循环水冷却的 方式可以保持恒定的温度。通常凝胶的温度控制在4 ℃或20~26 ℃。

7. 电压

电压对于凝胶电泳的影响作用可能是通过改变温度而形成。在低电压、长时间的条件下可得 到较好的结果。也有实验者采用先以高电压电泳，然后降低电压的电泳条件，亦能取得良好的实验结果。

8. 凝胶电泳的方式
一般SSCP分析应用的是平板聚丙烯酰胺凝胶电泳，辅以放射性自显影或硝酸银染色等技术示结果。目前国内外许多研究者用毛细管聚丙烯酰胺凝胶电泳进行SSCP的研究；利用毛细管 电泳进行PCR-SSCP时一般釆取荧光检测法。

荧光检测法灵敏度高、特异性好、结果便于判读。 但是荧光标记延长了实验过程，成本较高。这些因素不利于毛细管电泳的推广，实际应用中，也 可直接利用紫外检测仪检测，也能检测到PCR产物的双链和单链DNA峰。这种方法简便，易于推广。