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聚合酶链反应一单链构象多态性分析 (PCR

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  聚合酶链反应-单链构象多态性分析(Single Strand Conformation Polymorphism Analysis of Polymerase Chain Reaction Products, PCR -SSCP)是近年来发展起来的一种基因分析方法。
 PCR -SSCP分析的基本程序为:首先PCR扩增特定靶序列,然后将扩增产物变性为单链,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外,更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下,DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定,其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用(主要为氢键)来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同,甚至单个碱基不同,所形成的构象不同,电泳迁移率也不同。PCR产物变性后,单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳,靶DNA中含单碱基置换,或数个碱基插入或缺失等改变时,因迁移率变化会出现泳动变位,从而可将变异DNA与正常DNA区分开。由此可见,PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术,它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。
  为了高灵敏特异性地显示SSCP分析结果,现已发展多种PCR -SSCP技术,各有其优势及适用领域。例如,可以在PCR扩增中用同位素或荧光素等标记引物或核苷,也可以在电泳后用银染或溴化乙锭染色以显示结果。这里将重点介绍最常用的放射性同位素PCR-SSCP法。在进行PCR扩增特定靶基因序列时,利用γ-32P-ATP标记引物或直接在PCR反应体系中加入α-32P-dCTP进行PCR扩增,使扩增产物带有同位素标记物,然后将扩增产物变性为单链进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,放射自显影显示结果。利用引物标记或碱基掺入法使PCR扩增产物带有同位素标记物,均可使产物信号增强几个数量级。二者相比较,前者经济、扩增特异性强,多用于大样本的检测和筛选;后者操作简便,适于一般实验室开展,可用于小样本或大样本的检测和筛查。本节仅介绍同位素标记碱基掺入法。
一、试剂准备
⒈ PCR 相关试剂
⒉ α-32P-dCTP
⒊ 30%聚丙烯酰胺 (29:1):丙烯酰胺29g、甲叉双丙烯酰胺 1g,溶于100ml ddH2O中,4 ℃保存。
⒋ 10%过硫酸胺配制方法:1g 过硫酸胺,溶于10ml ddH2O中,4 OC保存(可用数周)。
⒌ TEMED(N,N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)
⒍ 5×TBE缓冲液:Tris碱54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA(pH 8.0) 20ml,加ddH2O至1000ml。
7.变性上样液:95% 甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.05%溴酚蓝、 20mM EDTA(pH 8.0)
二、操作步骤
⒈ PCR扩增
反应总体积为10μl,在0.5ml微量离心管中加入下列反应成分:
10×buffer   1μl
dNTPmix    70μM
DNA模板 100ng
引物及Taq DNA酶 依实验设计要求按比例加入
α-32P­-dCTP   0.1μl
加ddH2O至   10μl
按实验设计循环参数进行扩增,获取扩增产物。
⒉ 聚丙烯酰胺凝胶电泳
⑴ 电泳槽玻璃板的处理:用洗涤剂清洗玻璃板,自来水反复冲净洗涤剂,双蒸水冲洗3次,晾干,95%乙醇擦拭,自然干燥。用棉签沾取SigmaCote涂于玻璃的贴胶面上, 5~10min后再用软纸擦拭除去多余的SigmaCote溶液。在两块玻璃内的两侧放好衬条对齐,用固定夹夹紧两块玻璃,并用玻璃胶带封边。
⑵ 制胶:按照被分离DNA片段的大小、含量及玻璃板、衬条的大小决定凝胶的浓度与体积,一般来讲使用5%~8%的凝胶较为合适。轻轻摇匀配制的胶液于真空抽气(开始时要缓慢)除气泡,加 35μl TEMED至聚丙烯酰胺混合液中,混匀。用10ml玻璃吸管或50ml注射器吸取胶液,将玻璃模具倾斜成60O角,缓慢注入两玻璃板间的空隙中,直至灌满模具顶部。立即插入相应的点样梳,(小心勿使梳齿下带进气泡,并且不要将梳齿全部插入胶内,留约2mm梳齿于玻璃板上端,以免拔梳时把胶孔拔断)。由于凝胶在聚合过程中有回缩,所以应小心添加些胶液于梳子处,水平放置,室温聚合1hr。将封口玻璃胶带掀去,放入电泳槽,凹型玻璃贴紧电泳缓冲液槽,用大号固定夹固定住两侧。在上下电泳槽内灌入 1×TBE电泳缓冲液。小心取出点样梳,用槽内的缓冲液反复冲洗点样孔,以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和气泡。
⑶ 扩增产物的处理:将 PCR扩增产物与变性上样液按1:5的比例加入0.5ml 微量离心管中,混匀。样品上胶前应98℃变性10min,立即冰浴骤冷。取约3~5μl变性样品(根据点样孔的大小决定上样量),以微量加样器上样,(上样时要注意不要有气泡冲散样品,而且速度要快,时间长了样品易于扩散)。
⑷ 电泳:电泳槽接上电极(上槽接负极,下槽接正极)开启电源,根据扩增片段的大小及电泳槽和凝胶的大小,决定电泳的电压及电泳时间。通常室温下以l~5V/cm电泳。
⑸ 剥胶:电泳结束后,倒弃电泳缓冲液,取下电泳胶玻璃,用塑料楔子从玻璃板底部一角小心分开玻璃,凝胶应附着在一块玻璃上,切去凝胶左上角,作为点样顺序标记。剪一张与玻璃同样大小的滤纸,严密覆盖于凝胶上,顺一个方向将凝胶缓慢取下,用保鲜膜盖于胶面并包好,避免膜和胶之间产生气泡或皱折,将凝胶固定在X线片夹中。

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