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PCR-单链构象多态性

实验分类:

PCR 技术

别名:

PCR-SSCP

最新修订时间:

简介

PCR-单链构象多态性是依据这种DNA单链构象特性,结合凝胶电泳技术,以检测基因变异的技术。目前,应用于PCR-单链构象多态性的方法主要有1种:PCR-单链构象多态性。

原理

PCR-单链构象多态性的基本原理是在非变性条件下,DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象;这种构象是由DNA单链中的碱基顺序决定,其稳定性靠分子内部的相互作用力(主要是氢键)来维持。

 

相同长度的单链DNA因其组成碱基顺序不同,甚至单个碱基不同,所形成的构象就有所不同。由 于聚丙烯酰胺凝胶电泳具有极高的解析和分辨力,在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶电泳时,DNA单链的迁移率除与DNA的长短有关外,更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。

 

DNA或RNA的PCR产物经变性处理后, 当靶DNA或RNA中因单个碱基置换、碱基插人或碱基缺失等改变时,其单链构象也发生改 变,这种构象的改变就可以通过中性聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率变化而体现出来。


PCR-单链构象多态性原理示意图:

应用

PCR-单链构象多态性常用应用领域如下:


1.    PCR-SSCP在疾病诊断中的应用


自1989年日本的研究工作者Orita等建立SSCP技术以来,SSCP技术作为检测基因突变的手段越来越受到重视。SSCP技术结合PCR技术,将经扩增的DNA序列进行SSCP分析,可快速检测已知突变、筛选未知突变,广泛地应用于癌症的研究和疾病的诊断。采用银染法代替同位 素标记法使PCR-SSCP技术更加快速、方便地应用于临床的诊断过程中。

 

朱斌等应用此方法检测 Leber遗传性视神经病;该基因位于第11号染色体上,患者的基因在第778位点上存在GA的突变;设计引物扩增641~980之间的340bp的片段;经SSCP分析和银染,结果表明在凝胶的前面的条带为未变性的双链DNA,正常的单链DNA的泳动速度要慢于突变的DNA的泳动速度,而杂合子基因通过电泳可以检测到两条正常单链和两条突变的单链。

 

由此可见SSCP技术 能快速地检测疾病,确定变异基因是纯合形式还是杂合形式。由于PCR技术的应用可降低样品量,这样可以用在胚胎早期的检测,从而预防有某些疾病的婴儿的出生,在优生优育中发挥重要作用。


林金容等通过PCR-SSCP建立起无创伤性结肠直肠癌的筛查方法。通过检测粪便中的APC (abenomatous polyposis coli)及 MCC (mutated in colorectal cancer)基因的突变来实现对疾病的 早期诊断和及时治疗,这对于提高结肠直肠癌的治愈率、延长患者的生命及提高患者的生存质量 起到关键作用。


2.    PCR-SSCP在分类学研究中的应用


PCR-SSCP技术是一种更为精细的分类技术,它可以区分某基因的单个核昔酸的差别,被广泛地应用到细菌、病毒及寄生虫等多种生物的分类当中。Vazquez用PCR-SSCP技术对克氏椎虫 Tep5-β基因家族中4个组分进行了分析,成功地鉴别了该复合基因族的不同形式以及自然状态下不同虫株的多态性,为寄生虫的分类开辟了新方式。

Koenig等对采自不同国家的甜菜坏死黄 脉病毒的不同基因组组分的特定片段扩增后进行SSCP分析,并根据SSCP图谱的不同将不同分离物划分为A、B和P三个株系群;其中SSCP图谱条带较少的仅发现于法国Pithirers的分离物,定位P株系群,只发现于法国和德国部分地区的为B株系群,其余为A株系群。

来源:丁香实验团队

操作方法

PCR-单链构象多态性

PCR-单链构象多态性是一种DNA单链凝胶电泳技术,它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。

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