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肝炎病毒的血清学诊断

相关实验:肝炎病毒实验室检测

最新修订时间:

简介

肝炎病毒的血清学检测结果是临床诊断的主要依据。HAV、HDV 和 HEV 的血清学诊断主要是依据血清中的 IgM 和(或)lgG 抗体的检出。HBV 的血清学诊断需检测血清中的三大抗原抗体系统和 DNA,检测结果对临床诊断。判断预后和抗病毒治疗疗效评价均有重要的意义。抗 HCV 抗体的检测是诊断 HCV 感染最常用的实验室方法,用于筛选输血员,诊断丙型肝炎以及评价治疗效果;HCV RNA 的检测可以进行基因分型以协助临床抗病毒药物及其疗程的选择。

原理

(一)HAV 的血清学诊断

1. 检测抗 HAV IgM 抗 HAV IgM 单份血清即可作出诊断,是目前甲肝病原学诊断最常用和可靠的方法,在临床和流行病学上均具有重要意义。抗 HAV IgM 在亚临床期即已出现,且滴度在感染后 3 个月内维持在 1:1 000 以上,可用作甲肝的早期诊断,也是近期感染的标志,同时还是区别急性感染和既往感染的有力证据之一。目前常用双抗体夹心 EL。ISA 和 IgM 抗体捕获(IgM antibody capture)ELISA 检测抗 HAV IgM,敏感性和特异性均较高。但应用 ELISA 检测抗 HAV IgM 抗体易出现假阳性,特别是易受类风湿因子的干扰,在操作过程中,应尽量避免受类风湿因子的影响。

2.检测抗 HAV lgG 当急性甲型肝炎患者出现症状时,应用竞争抑制 ELISA 即可在血清中检出抗 HAV IgG,初期滴度低,以后逐渐升高,病后 3 个月达高峰,1 年内维持较高水平,以后持续低水平在血中可维持数十年甚至终身。如双份血清的抗 HAV IgG 滴度,恢复期血清比早期血清有 4 倍以上增高,可诊断甲型肝炎。抗 HAV IgG 检测主要用于监测人群免疫水平的流行病学调查。

(二)HBV 的血清学诊断

主要检测血清中的 HBsAg,抗 HBs ,抗 HBc IgM,抗 HBc IgG ,HBeAg 及抗 HBe 等 HBV 血清标志物(HBV markers,HBV-Ms)和 HBV DNA。DNA 的检测如前所述,抗原抗体的检测最常用的方法是酶联免疫吸附试验(ELISA)和固相放射免疫试验(SPRIA 或 RIA),是检测乙型肝炎病毒血清标志物的首选方法。

(1)ELISA:主要包括双抗体夹心法、双抗原夹心法和竞争法。ELISA 灵敏性高,成本低,适用于普通患者筛查。试验中要尽量避免各种因素的干扰,如加酶结合物后的洗涤一定要彻底,避免假阳性;孵育温度和时间要准确;不同批号的试剂不能混用。为避免各种因素影响,结果测定最好选用全自动酶标仪;底物液一定要临用前配制并避光,加底物前检查颜色是否变黄,变黄则应重新配制。

(2)SPRIA:原理与 ELISA 法相同,只是标记物为放射性物质。固相放射免疫试验以放射性碘-125 为标记物,要严格按照有关规定进行操作和废物处理。

近年来新发展的微粒子酶免疫分析(MEIA)检测 HBsAg 是目前世界上检测乙型肝炎病毒标志物的金标准,采用顺磁性微粒作为固相载体,用稳定的 4-甲基磷酸伞形酮(MUP)测出荧光发光的强度来检测被测物的浓度,对 HBsAg 检测不但灵敏度高且抗干扰能力强,重复性好,并可单份检测,可检出人群中低浓度和自然感染获得的乙型肝炎病毒核心抗体。化学发光法定量检测价格昂贵,可用于 HBV-Ms 为临界值的患者的确证,并可间接反映宿主 HBV 的复制水平,在评价抗病毒治疗的病毒学应答、疗效和判断预后方面有重要意义。胶体金免疫层析实验(GICA )以胶体金作为标志物,利用层析作用来检测抗原或抗体。与 ELISA 检测表面抗体相比,胶体金层析试纸条可测末梢全血和血清,即时采即时测,操作简单,可最大限度地避免检测过程中各种因素对结果的影响。GICA 检测 HBsAg 具有简便快速、不需要仪器设备等优点,但灵敏度较低,对部分弱阳性标本易漏检。GICA 适用于大规模人群普查 HBsAg 的感染,以及临床急诊标本和义务献血现场筛查等快速检测。

材料与仪器

器材:HEV 第 Ⅰ、Ⅱ 基因型的重组蛋白或合成肽

步骤

(一)HCV 的血清学诊断

一般抗 HCV IgM 或 IgG 阳性者血中含有 HCV RNA,其血液有传染性,因此所有供血者均应通过 HCV 血清学检测进行筛选。若抗 HCV IgM 阳性可对 HCV 感染进行早期诊断,但 HCV IgM 抗体存在与否不能提示病毒复制状态;HCV lgG 抗体则是筛选慢性丙型肝炎主要指标。由于抗 HCV 出现较晚,急性肝炎患者即使抗 HCV 阴性也不能完全排除 HCV 感染。HCV IgM 抗体检出率较低,如只检测此项容易造成漏检,因此,需同时检测 HCV RNA,后者是反映病毒复制的可靠指标。

HCV 抗体检测方法:分为筛选试验和确认试验,筛选试验主要采用 ELISA 方法,确认试验采用重组免疫印迹试验(recombinant immunoblot assay,RIBA)。

筛选试验(ELISA):由于 HCV 感染人体后机体所处的免疫状态和感染阶段不同,机体针对病毒特定蛋白产生的特异性抗体出现的时间也不同,HCV 结构区和非结构区的每一片段抗原都有不同的血清学诊断意义。目前广泛使用的抗 HCV lgG ELISA 第三代试剂,是将 HCV 的 C。NS3,NS4 和 NS5 作为抗原,检测患者血清或血浆中的抗 HCV lgG。这种方法有较好的敏感性,检出率可达 90% 以上,但可能会出现假阳性。对测定比值不高的阳性结果应做确认实验加以证实。

确认试验(RIBA):选用重组抗原 cl00p、c33c、c22p、NS5,以及两个质控对照超氧化物歧化酶(SOD)和 IgG。包被在硝酸纤维素膜上,加入待检血清和酶标记的第二反应系统,根据底物显色来判断结果。

HDV 感染的血清学诊断主要通过测定血液的 HDV Ag。抗 HDV IgM 和抗 HDV lgC,同时结合 HBV 的血清学检测协助诊断。HDV Ag 刺激机体产生的抗 HDV 无保护作用,抗体阳性并不表示病情恢复。抗 HDV IgM 和 IgG 的检测可区分 HDV 新近感染和既往感染,抗 HDV IgM 的波动还与肝损伤的程度相关。

HDV Ag 主要存在于肝细胞内,亦可存在于感染早期的血清中,应用抗 HDV 可以检测肝组织中的 HDV Ag。血清 HDV Ag 出现早,临床症状出现即可查到,滴度高,时间短,平均存在时间为 6 天,很快消失,故不易检出。

(二)HEV 的血清检测

1. 抗 HEV 检测包括 IgM 和 IgG 检测。

(1)抗 HEV lgG 检测:特异性血清学检测采用的已知抗原多为来源于 HEV 第 Ⅰ 、Ⅱ 基因型的重组蛋白或合成肽。

方法:一般采用 ELISA 法。

原理:将化学合成的 HEV 多肽或基因工程表达的 HEV 抗原固定于微量反应板中,加人待检血清共同孵育,样本中如有特异抗体将与 HEV 结合为免疫复合物,它将与酶标记的抗人 lgG 抗体结合,加入底物显色,据其深浅可判断血清中是否存在抗 HEV lgG。

结果判断:根据试剂盒内说明书设置一定阴性,阳性对照以及质控,并计算 Cut-off 值决定临界值。样品 A 值小于临界值为阴性,否则为阳性。在疫区的标本应重复检测。

临床意义:抗 HEV IgG 阳性时可认为有 HEV 感染,但需排除甲、乙,丙型肝炎后才能确诊。

(2)抗 HEVIgM 检测:其方法为 ELISA 法,原理将抗 HEV IgG 检测中酶标记抗体换为抗人 IgM 即可,结果判断如抗 HEV IgG 检测。

临床意义:抗 HEV IgM 在 HEV 感染早期出现,是 HEV 近期感染的标志物,一般在发病 6 周达高峰后下降,12 周消失。如果试剂盒不采用抗人 u 链酶标时,结果会受风湿因子(RF)等其他因素干扰。

2. HEV Ag 检测 HEV 结构蛋白 ORF2 的 E2 片段可以自发形成二聚体,对戊肝恢复期血清有极强的反应性,这一反应性随着二聚体的解聚而消失,因此可利用此反应对 HEV Ag 进行检测。戊肝急性期血清和多年后的恢复期血清 E2 抗原反应性明显,恢复期血清的反应性集中在二聚体上。

目前肝炎病毒的抗原抗体系统通常用的酶联免疫吸附试验与放射免疫法,有经卫生部门批准的各型肝炎病毒感染指标的检测试剂盒出售,不同试剂盒的 Cut-off 值确定及阳性标准可能有所不同,应依所用试剂盒说明书为准。病毒核酸的检测用斑点法、杂交法和 PCR,近年多用荧光实时定量 PCR 进行核酸的定性和定量,其敏感度及特异度优于普通 PCR。

注意事项

( 1 ) HBsAg:HBsAg 是 HBV 在肝细胞表达的产物,是机体感染 HBV 后最早出现的血清学标志之一,感染后 4~7 周血清中出现 HBsAg,之后可能出现 ALT 异常和临床症状。

HBsAg 的检测是 HBV 感染最为常用及非常重要的指标,在 HBsAg 阳性的各类人群中,为数最多的是无症状 HBsAg 携带者,我国约有 1.2 亿人。无症状 HBsAg 携带者是指肝功能正常,无任何临床症状和体征,在体检或献血时才发现 HBsAg 阳性。

HBsAg 阳性的意义:① 急性乙型肝炎的潜伏期和急性期(大多数短期阳性);② 慢性乙型肝炎;③ 无症状 HBV 携带者;④ 无症状 HBsAg 携带者;⑤ 与 HBV 感染有关的肝硬化和原发性肝细胞癌等。另外,HBsAg 阴性并不能完全排除 HBV 感染,因为 s 基因突变或低水平表达可使常规检测方法难于检出,应引起注意。S 基因变异可导致隐匿性 HBV 感染( occult HBVinfection),表现为血清 HBsAg 阴性,但仍可有 HBV 低水平复制。

(2)抗 HBs:抗 HBs 是 HBsAg 刺激机体产生的特异性中和抗体,是保护性抗体。一般在初次感染 HBV 后 6~23 周出现,表明机体已产生免疫力。抗 HBs 阳性可见于:① 乙型肝炎恢复期,在 HBsAg 消失后间隔一定时间出现抗 HBs;② 隐性感染的健康人,自身产生了免疫力;③ 注射乙肝疫苗或乙肝高效价免疫球蛋白(HBIG)后,产生主动或被动免疫。

PreS1、PreS2 及其相应抗体:HBV 的外膜蛋白 PreS1 抗原和 PreS2 抗原均与病毒的复制有关,其含量变化与外周血中 HBV DNA 的含量成正比,出现早,消失快,因此,PreS 抗原的检出可作为 HBV 复制的指标。抗 PreS 存在时间短暂,为 6~12 个月。多数报道认为抗 PreS 的出现与乙肝的恢复有密切关系,若抗 PreS 出现于急性乙肝恢复期的早期,表示病毒正在或已经被清除,预后好;若抗 PreS 迟迟不出现,则预后较差。另一些研究则认为抗 PreS 同时反映病变的活动和病毒的清除。

(3)抗 HBc:是 HBV 核心抗原刺激机体产生的相应抗体, HBcAg 仅存在于感染的肝细胞内,不释放到血清中,因而 HBV 血清学检测不包括 HBcAg。抗 HBc 分 IgM 和 IgG 两型,均无保护性。感染 HBV 后首先出现抗 HBe IgM ,通常在出现症状时即可检出,一般持续约 6 个月,提示 HBV 处于复制状态,是 HBV 急性感染的重要指标,也是慢性活动性肝炎的重要标志。抗 HBc IgG 在抗 HBc IgM 下降及消失后出现,可伴随感染者终生存在。抗 HBc 阳性主要见于乙肝恢复期、慢性感染和既往感染。母传抗 HBc 在婴儿体内可持续 1 年以上。

(4)HBeAg:HBeAg 为可溶性蛋白质,几乎与 HBsAg 平行出现,但较 HBsAg 消失早。HBeAg 阳性主要见于 HBsAg 阳性的乙肝患者和 HBsAg 携带者,其中大多数伴 HBV DNA 和 HBV DNA 聚合酶(HBV DNA-P)阳性。检测 HBeAg 的意义如下:① 急性乙型肝炎的辅助诊断, HBeAg 在急性乙型肝炎潜伏期的后期出现,表示处于感染早期,可辅助诊断急性乙肝;② HBeAg 阳性是体内 HBV 复制。传染性强的标志;③ HBeAg 也是判断预后的指标。急性乙型肝炎发病 3~4 个月 HBeAg 转阴,表示 HBV 停止复制,预后良好;若 HBcAg 持续阳性,则预后不良,易转为慢性;④ HBV 前 C 区基因突变形成的 HBV 变异株不分泌 HBeAg,HBeAg 虽阴性,但病情反复活动、迁延,预后不良,应结合 HBV DNA 等指标作出判断。

(5)抗 HBe:抗 HBe 只有一种 IgG 抗体,抗 HBe 一般存在于无症状 HBV 携带者及非活动期慢性肝炎患者中。一般在 HBeAg 消失后出现,此时表示 HBV 在体内复制减少或终止,传染性减弱或消失,病情开始恢复。但有些 HBV 感染者 HBeAg 消失后不出现抗 HBe,表现为 HBeAg 和抗 HBe 均阴性,可见于:① 病毒已清除,但无抗 HBe 应答;② 病毒复制一时减少,HBeAg 消失后可再重现;3 HBV 前 C 变异,不能合成 HBeAg。③ HBV-Ms 检测结果的综合判断三大抗原抗体系统是判断 HBV 感染状态主要的、常用的指标。但是,由于这些指标与 HBV 感染后转归的关系较为复杂,无论是临床诊断还是从事研究,在对患者或研究对象做出准确诊断时,均应对几项指标同时分析,并结合临床表现、肝功能的改变及其他 HBV 感染标志进行综合评判,必要时进行动态观察。

来源:丁香实验

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