肝炎病毒的标本采集和处理方法

病原学来源不同的肝炎其实验室检测差异较大，病原学诊断主要涉及甲、乙、丙、丁、戊五型，包括各种肝炎病毒的核酸定性及定量，抗原组分及抗体等三个层次的检测，检查的目的是明确肝炎病因及病毒核酸复制的情况，以协助临床诊断和治疗、流行病学调查以及环境监测。

目以 HAV 和 HBV 感染为例，HAV 感染的实验室检测主要包括三个方面：① 在潜伏期或急性期检查粪便中的甲型肝炎病毒抗原，因为量少且持续时间短，实际很少应用；② 检测发病早期和恢复期双份血清中的抗 HAV 抗体；③ 检测单份血清中抗 HAV IgM 抗体，以区别急性感染与既往感染。

HBV 感染的实验室检测主要包括四个方面：生物化学检测，HBV 血清标志物检测、HBV 分子生物学诊断以及 HBV 临床药物疗效检测。HBV 病原学诊断主要依据 HBV 血清标志物作出判断，包括病毒的抗原抗体及病毒的核酸两方面。

肝炎病毒的实验室检测所涉及的临床标本主要包括血液、肝组织、粪便等，唾液、乳汁、阴道分泌物、精液等体液样本主要用于流行病学调查。肝炎病毒在动物体内增殖后分离最常用肝组织样本，环境标本如贝类样品、污水或其他水源样品主要用于环境监测和流行病学调查等。

1. 粪便标本﹑提纯粪便标本：取采集的粪便标本 5 g，用 pH7.4 50 mmolL 的 Tris-HCl 缓冲液制成 10%~20% 的悬液。反复冻融 3 次，或超声波破碎（20 000 Hz）3 次，每次 30 秒，4 ℃过夜；4 000 r/min 离心 15 分钟，取上清加入 PEG-6 000，使其终浓度为 10%，再加入 NaCl，使其终浓度为 0.4 mol/L，4 ℃过夜；次日在 10 000 r/min ，4 ℃离心 30 分钟取沉淀，用 Tris-HCI 缓冲液溶解至原体积；加入等体积三氯甲烷，置振荡器上振荡 30 分钟，取水相；在沉淀中加入 Tris-HCI 缓冲液，振荡 30 分钟，再经 3 000 r/min 离心 30 分钟，取水相；将两次水相合并，加入 PEG 和 NaCl，同前过夜、离心，沉淀，用 Tris-HCI 缓冲液溶解至原粪便悬液的 1/10 体积，备用。

2. 血液标本分离血清：采集的全血样本室温放置 2 小时（不要超过 6 小时），待凝固后分离血清，或 2 000~2 500 r/min 离心 5~10 分钟分离血清，24 小时内完成检测，或置于 -20 ℃保存（采集的血清样本可保存数年至数十年），或长期冻存于 -70 ℃，可保持抗体的滴度。检测抗原抗体时，被检血清 1∶4 稀释后 56 ℃灭活 30 分钟。检测病毒核酸时，核酸提取前先将标本中的病毒超速离心浓缩，加促沉剂糖原及 PEC 充分混匀，冰浴 0.5~1 小时或 4 ℃过夜，2600 r/min，4 ℃离心 1.5 小时，保留底层液体及沉淀物进行核酸提取。检测 HBV 抗原和核酸时采集全血标本后分离白细胞及外周血单核细胞；HBV 分离时采集抗凝血液标本后分离细胞于液氮或超低温冰箱保存。

3. 组织标本，如从绒猴肝组织中提取病毒时，将肝组织剪碎，研磨制成匀浆，低速离心除沉渣，上清液进一步用 CsClI 作等密度超速离心，取沉淀物进行检测。另外，用细胞培养收获的病毒，需用超声波破碎﹑冻融等使其与细胞成分分离。

4. 贝类样本 HAV 通过感染者粪便可污染水源及贝类等海产品，因此病毒学检测中需检测贝类样品如牡蛎中的 HAV。肝炎病毒在环境中存在浓度极低，而且其核酸在环境中极易降解，采集的样本需经过浓缩富集病毒，可大大提高核酸检出率。具体方法：采集贝类样品（可取整只贝去壳或仅取贝的胃肠组织）后匀浆，使用缓冲液和 PEC 将病毒从贝类样品中洗脱并沉降下来，用苏氨酸缓冲液重新洗涤，离心后，将上清与第一次洗涤的上清混合，再进行 PEG 沉降，可增加 HAV 病毒的回收率。这一方法可将病毒与贝类组织初步分离并使病毒得到富集，富集后的病毒浓度可提高几十甚至百倍。

其他样本中，采集的乳汁 4000 r/min 离心 10 分钟，弃上层脂肪，取中间乳清进行抗原抗体或核酸检测，或置于 -70 ℃保存备用。采集的唾液样本 4000 r/min 离心 10 分钟后，取上清液进行检测。