器材：

①注射器

②无菌手术器械

③细胞培养皿

④移卵针

⑤37 ℃、5％CO₂ 培养箱

⑥倒置显微镜、体视镜

⑦PCR 仪、电转仪、离心机

试剂：

①材料：猪

②孕马血清促性腺激素、人绒膜促性腺激素

③DPBS

④透明质酸酶

⑤戊巴比妥钠溶液

⑥70％ 乙醇

⑦胰酶溶液（Trypsin-EDTA）

⑧冻存液、操作液、DMEM 培养基、PZM-3 液、NCSU23-BSA 液

⑨PVA-TL-Hepes

利用体细胞核移植技术制备转基因猪的基本过程可分为如下几步：

（一）猪供体细胞（胎儿成纤维细胞）的分离培养

1．猪胎儿组织的获取

（1）将怀孕 35～40 天的妊娠母猪麻醉。

（2）手术剖开腹腔，将整个子宫取出。

（3）将包裹胎膜的胎儿取出置培养皿中，在超净工作台中去除胎膜，暴露胎儿。

（4）用 DPBS 彻底冲洗胎儿 3 次。

（5）去除胎儿的头和内脏（肠、肝、心脏等）。

（6）在 DPBS 中用灭菌的眼科剪将胎儿组织剪碎成为 1 mm³ 的小块。

（7）收集剪碎的组织块至 15 mL 离心管，沉降弃上清液。

2．猪胎儿组织消化

（1）将组织块转移至 50 mL 离心管中。

（2）加入 10 mL 胰酶溶液（Trypsin-EDTA）。

（3）39 ℃ 振荡 30 分钟。

（4）用枪头吹打分散组织块。

（5）静置片刻，去除沉底的残留组织块。

（6）500 g，5 分钟离心细胞悬液，弃上清。

（7）用细胞培养液重悬细胞铺 10 cm 培养皿，39 ℃，5％CO₂ 培养箱中培养。

3．猪胎儿成纤维细胞传代培养 待细胞生长汇合后，需要对细胞进行传代扩增培养。

（1）吸弃细胞培养液。

（2）用 DPBS 洗细胞。

（3）加适量 0.05％ 胰酶覆盖细胞表面，39 ℃ 孵育 5 分钟。

（4）加等体积的含血清细胞培养基，吹打皿底，收集细胞至 15 mL 离心管。

（5）静置片刻，去除沉底的残留组织块。

（6）500 g，5 分钟离心收集细胞。

（7）弃上清，用细胞培养基重悬细胞。

（8）按照 1：3 的比例传代培养。

4．细胞冻存

（1）按照步骤 3 传代培养中的方法消化、离心收集细胞。

（2）用细胞冻存液重悬细胞，计数，根据计数结果用冻存液将细胞悬液调整至 10⁷ 个／mL。

（3）分装细胞至冻存管中（每管 100 μl）。

（4）将冻存管置于程序冷冻盒中，置-80 ℃ 冰箱，过夜。

（5）将冷冻管从-80 ℃ 冰箱取出，投入液氮，长期保存。

5．细胞解冻

（1）从液氮中取出细胞冻存管，投入 37 ℃ 水浴解冻。

（2）细胞转移到装有细胞培养液的 15 mL 离心管中混匀，500 g，5 分钟离心，弃上清，收集细胞。

（3）用细胞培养液重悬细胞，铺于 10 cm 培养皿中，置 39 ℃，5％CO₂ 培养箱中培养，每隔 2～3 天传代一次。

（二）卵母细胞的准备

1．卵母细胞的采集

（1）从屠宰场收集卵巢于灭菌的生理盐水中，30～35 ℃ 保温，4 小时内送回实验室。

（2）卵巢用 37 ℃ 生理盐水冲洗 3～4 次，清除血污。

（3）用配有 18 号针头的 10 mL 注射器抽吸直径 3～6 mm 的卵泡内容物，置于 37 ℃ 保温的离心管中。

（4）卵泡液静止 5 分钟，弃上清，用 PVA-TL-Hepes 洗 3 遍。

（5）在体视镜下挑出胞质均匀，外裹多层卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合体（COCs），在 PVA-TL-Hepes 液中洗 2 遍，然后在成熟液中洗 3 遍。

（6）COCs 置于 4 孔板中成熟培养，每孔 40～70 枚，置于饱和湿度，39 ℃，5％CO₂ 培养箱中培养 42～44 小时。

2．成熟卵母细胞的处理

（1）成熟培养 42～44 小时的猪卵母细胞置于含 1 mL 透明质酸酶（1 mg／mL）的 1.5 mL 离心管中。

（2）剧烈振荡 4～5 分钟，移至含操作液的 35 mm 培养皿中。

（3）将质膜完整、外形规则，有明显卵周隙的卵母细胞转移至新的操作液中待用。

（三）供体细胞的处理

1．周期细胞（cycling cells）的获得

（1）复苏细胞，并传代培养至 24 孔板或 4 孔板中。

（2）培养 2-3 天后，待细胞生长汇合消化收集细胞。

（3）离心收集的细胞用 200 μl 操作液重悬，用作核移植供体细胞。

2．G 期细胞的获得（血清饥饿法）

（1）解冻细胞，铺于 24 孔板或 4 孔板中培养。

（2）12～24 小时后，细胞生长汇合时吸弃培养基，加入 500 μl 含 0.5％FBS 的 DMEM 培养基，培养 5 天。

（3）换液，加入 500 μl 含 0.1％FBS 的 DMEM 培养基，继续培养 3 天。

（4）消化，离心收集细胞。

（5）用胚胎操作液重悬细胞，用作供体细胞。

3．G2／M 期细胞的获得

（1）解冻细胞，铺于 24 孔板或 4 孔板中培养。

（2）12～24 小时后，细胞生长汇合时吸弃培养基，加入 500 μl 含 1.0 μmol／L 秋水仙胺（colchicine，Sigma，C9754）的细胞培养基，培养 24 小时。

（3）消化，离心收集细胞。

（4）用胚胎操作液重悬细胞，用作供体细胞。

4．解冻细胞的准备

（1）37 ℃ 水浴解冻细胞，加入 200 μl DPBS。

（2）室温放置 30 分钟。

（3）加入 800 μl 细胞培养基，500 g 离心 5 分钟，弃上清。

（4）加入 50～100 μl 操作液重悬细胞，用作核移植供体细胞（图 5-1-27）。

（四）核移植

1．成熟卵母细胞的去核

（1）成熟卵母细胞在含 5 μg／mL bisbenzamide（Sigma，B1155）的操作液中染 30 分钟。

（2）然后将卵母细胞转移至覆盖矿物油的去核小滴中，放置 5 分钟。

（3）在显微操作仪下，用直径 25～30 μm 的去核管将第一极体及其附近包含中期核的部分胞质吸出。

（4）在紫外光下确认吸出的胞质中含有中期核染色体。

2．供核细胞核导入

（1）直接注射法

1）卵母细胞分批去核完成后置于胚胎培养液中，放回培养箱恢复 30 分钟。

2）换上直径 10 μm（G／G，期细胞）或 15 μm（G2／M 期细胞）带尖的注射针，将去核卵母细胞及供体细胞置于矿物油覆盖的显微操作小滴中。

3）用注射针反复吹吸供体细胞，使其细胞膜破裂。

4）将供体细胞核连同残留的胞质成分一并吸入注射针，从去核时留下的透明带缺口进入去核卵母细胞，穿破质膜，将供体核及胞质成分注射到去核卵母细胞中。

（2）融合法

1）去核操作滴中，每个卵母细胞去核完成后，吐出吸取的卵母细胞核和极体。

2）用去核管吸取一个供体细胞，从去核时形成的透明带缺口进入，将供体细胞置于透明带下，用去核针挤压透明带，确保供体细胞与受体卵母细胞胞质紧密接触。

3）去核、注核完成后，卵母细胞-体细胞对置于 NCSU23-BSA 液中，放回培养箱，等待融合操作。

4）调整电融合仪参数：1.20 kV／cm，30 微秒直流电脉冲，2 次，间隔 1 秒。

5）待融合的卵母细胞-体细胞对在融合液中洗 3 遍后，置于覆盖融合液的融合电极之间，用玻璃微针拨动，使得卵母细胞-体细胞接触面与电极方向平行，触动电极按钮，执行电脉冲进行细胞融合。

6）电刺激后的细胞对置于培养液中培养 30 分钟，体视镜下检查融合情况，置培养箱中继续培养。

3．激活

（1）电激活：成熟的猪卵母细胞很容易被电刺激激活，采用以上电融合的参数就可以实现重构胚胎的激活。核移植时如果采用的是电融合的方法，则无需进一步对重构胚进行激活处理，融合的同时胚胎已经激活；而如果采用直接注射的方法，需要对重构胚进行激活处理，此时如果采用电激活，只需要将重构胚采用与电融合相同的参数进行电脉冲刺激即可。

（2）化学激活：猪卵母细胞也可以在化学激活剂的作用下激活，常用 Thimerosal 与 DTT 的共处理进行猪卵母细胞或重构胚胎的化学激活。

1）卵母细胞或重构胚在 200 μmol／L Thimerosal（Sigma，T2295）中处理 10 分钟。

2）卵母细胞或重构胚在操作液中洗一遍。

3）卵母细胞或重构胚在 8 mmol／L DTT（Sigma，45777-9）中处理 30 分钟。

4）卵母细胞或重构胚在操作液中洗一遍。

5）卵母细胞或重构胚在胚胎培养液中洗两遍，置培养箱中培养。

（五）胚胎的体外培养

激活后，重构胚胎置于含 500 μl 胚胎培养液的四孔板中，矿物油覆盖，置于饱和湿度，39 ℃，5％CO₂ 培养箱中培养。激活后 8～15 小时可以观察到原核形成，24～36 小时后可以观察到卵裂，6～7 天形成囊胚。

（六）胚胎移植

1．胚胎移植受体猪的准备 自然发情受体猪：对一定数量的母猪每天两次进行发情检测，选择胚胎移植前一天或移植当天发情的健康母猪作为胚胎移植受体。受体猪同期发情也可用药物诱导，实验方法为：

（1）根据受体猪发情情况及移植计划，对一定数量的受体猪每天的饲料中掺入 18～22 mg Regu-Mate。

（2）停止饲喂 Regu-Mate，105 小时后肌内注射 HCG1000U。

（3）HCG 注射后 22～26 小时进行胚胎移植。

2．胚胎移植手术操作

（1）受体猪用速眠新诱导麻醉，带上麻醉面罩，打开麻醉机，用异氟烷维持麻醉。

（2）采用常规外科手术方法在腹中线倒数第 2 对乳头处切 7～10 cm，牵引出一侧子宫角，并沿子宫角、输卵管取出该侧卵巢，以 37 ℃ 生理盐水冲洗子宫与卵巢，以保持生殖道温度与湿度，并观察排卵情况。

（3）将胚胎从培养箱取出后置于操作液中，39 ℃ 保温箱中运输至移植手术点。

（4）体视显微镜下，用 1 mL 注射器将胚胎吸入胚胎移植管中（Tomcat catheter，Sherwood Medical，St.Louis,MO)。

（5）将装有胚胎的移植管插入输卵管，尽量送入输卵管深部，慢慢推出胚胎后撤出移植管。

（6）将输卵管、子宫复位，在切口敷以青霉素和链霉素，按腹膜、皮下筋膜、皮肤三层缝合。

二、基于徒手操作的克隆技术（徒手克隆）制备转基因猪

1．猪体外成熟卵母细胞的获取-按本书之前方法收集培养卵母细胞。

2．猪供体细胞的准备-按本书之前方法培养准备供体细胞。

3．卵母细胞的切割去核

4．重构克隆胚胎

（1）融合与激活

1）第一次电融合：第一次融合参数为 200 V／cm，9 微秒。取一半数量的切好的半卵（胞质）用来做融合受体，即细胞质与体细胞的融合，每次取 2～3 个半卵放入 PHA（1 μg／mL）中约 3 秒钟，移入并粘贴已经被消化好的保存在 T2 液滴中的体细胞，一个半卵对应一个体细胞，粘好之后放入融合液里面平衡，重复上述工作。随后在融合槽中按照图 5-1-35 所列出的方式进行电融合。电击之后，把卵-体细胞移入 T11 液滴中，直至全部完成。

2）第二次融合和电激活：第二次融合和电激活参数为 86 V／cm，80 微秒。将上述已经融合了体细胞的卵与被保留的一半数量的半卵一一对应进行第二次融合。在 T2 液滴中培养 15～20 分钟直到两个半卵融合成一个重构胚。

3）化学激活与体外培养：随后把重构胚移入含有 5 μg／mL CB 和 10 μg／mL CX 的 PZM-3 液体中进行化学激活。3 小时之后，把化学激活后的重构胚在无 CB 和 CX 的 PZM-3 液中洗 2～3 遍，移入已经做好的小孔里，在 PZM-3 液体中进行体外培养，培养箱的条件是含有 5％O₂,5％CO₂,90％N₂,38.5 ℃，100％ 湿度。每隔 1 天，取出并观察分裂情况，做好笔录（取出时一定要小心，否则卵很可能会从小孔里面被晃悠出来）。

5．胚胎移植

1）移植胚胎选取：由于徒手克隆胚胎是没有透明带的胚胎，因此要在克隆后的第 5 天和第 6 天（克隆当天为第 0 天），选取发育到桑椹胚和囊胚的克隆胚胎（图 5-1-38）。然后利用保温箱把选出的用来移植的胚胎运送到进行手术移植的猪场。

2）胚胎移植：在猪场准备好母猪受体，母猪受体发情期应该与胚胎的发育期基本一致，即发情第 4～5 天的母猪作为胚胎移植的受体，通过手术的方法找到受体母猪的输卵管和子宫角。把胚胎利用 1 mL 注射器吸入与其连接的管，按照液体-气泡-液体-气泡-胚胎和液体的顺序把胚胎吸入，并移入已经手术准备好的母猪受体中（图 5-1-39），随后手术缝合。从 20 天之后每周检测一怀孕情况。

3）克隆小猪：在第 114～117 天观测怀孕受体母猪的孕情，随时准备接生克隆小猪的出生。

三、供核细胞的基因转染和筛选

1．按照本节前面所述的实验步骤，将冷冻保存的猪胎儿成纤维细胞解冻后传代培养，至 70％～80％ 汇合。

2．吸弃培养液，按照本节前述步骤消化、离心、收集细胞，并用 PBS 洗 1～2 次。

3．用无抗生素的 PBS 悬浮收集的细胞并计数，调整细胞密度至 5x10°个／mL。

4．每次取 200 μl 细胞悬液加入电击杯，然后加入纯化的线性 DNA 4 μg，轻轻敲击杯底混合，置于电击槽中。

5．根据所使用的电击杯规格或设备型号设置相应的参数组合进行电击（参考参数：U：230 V；TC：5ms；No：1；Cuvettes：0.4 cm），电击后室温静置 2 分钟，然后将其加入到含培养液的六孔细胞培养板中，置培养箱培养。

6．根据转基因载体的设计方案进行筛选；如载体中有筛选标记基因（如新霉素抗性基因），转染的细胞在培养 48 小时后，加入含有筛选药物（G418）的培养液进行筛选，每两天更换一次培养液，两个星期后，观察每孔中细胞克隆的形成数；如载体中不含有筛选标记基因，可通过梯度稀释培养，分离单克隆，然后逐个鉴定。

7．细胞克隆传代，进行转基因鉴定。