材料与仪器
器材:
① 流式细胞仪管
② 手术器械
③ 1 mL 注射器
④ 流式细胞仪(BD FACSCalibur)。
试剂:
① e-Kit-APC
② Sca-1-FITC
③ phycoerythrin-conjugated lineage marker cocktail
④ containing CD3-PE
⑤ CD5-PE
⑥ B220-PE
⑦ Gr-1-PE
⑧ Ter119-PE(eBioscience)
⑨ 1x PBS
⑩ FBS。
步骤
流式细胞术检测检测胎肝 Lin-c-Kit+Sca-1+细胞数的基本过程可分为如下几步:
A 收集 E14.5 胎肝细胞,1 mL 注射器分离胎肝成单细胞悬液,并用细胞滤器过滤细胞悬液。
B 胎肝总细胞数计数。
C 2% FBS/PBS 液洗一次。
D 分别加入 c-Kit-APC(1:800),Sca-1-FITC(1:800),phycoerythrin-conjugated lineage marker cocklail(1:800),Ter119-PE(1:800)。
E 4 ℃ 孵育,30 分钟,避光。
F 加 500 mL 2% FBS/PBS 液,微振荡。
G 250 g 离心 5 分钟。
H PBS 液离心洗 2 遍,每次 5 分钟;流式细胞仪分析 Lin c-Kit'Sca-1'细胞数。结果示例如图8-8-3。
注意事项
1. 正式收取数据前要先用空白对照和单染的阴性对照,做好仪器的校正工作。
2. 上流式细胞仪的细胞液样本绝对不容许有组织残留,否则极易引起仪器内部管道堵塞。
来源:丁香实验