简介
激素通过调节各项生理活动来为机体营造一个稳定的内部环境，它能够控制机体的生长、发育、繁殖、能量代谢稳态及促进机体对不同生理和心理刺激的适应。根据化学结构，激素可分为 4 类：类固醇，氨基衍生物，肽类与蛋白质类，脂肪酸衍生物，它们通常是通过改变各种酶的催化活性，改变细胞膜的转运能力及诱导分泌活动来发挥其功能。
因此，在对机体内分泌和代谢系统的研究过程中，除了常规的血生化检测外，还需要测定各种激素水平的指标。测试的范围涉及下丘脑-垂体轴 ［卵泡刺激激素（FSH），促黄体生成激素（LH），生长激素（GH），促肾上皮质激素（ACTH）］，胰腺内分泌（胰岛素和胰高血糖素），类固醇类激素（雌二醇，孕酮，睾酮，皮质酮），甲状腺激素（T3，T4），脂肪组织分泌激素（脂联素，瘦素）。
材料与仪器
器材：酶标仪（SunriseTM,TECAN）
试剂：
Rat/Mouse Insulin ELISA kit（Cat:EZRMI-13K，LINCO Research）
步骤
激素水平检测实验的基本过程可分为如下几步，以小鼠血清胰岛素的测定（ELISA）为例（测定的具体步骤根据 ELISA kit 的使用说明书来进行。我们所使用的 Linco 公司的 Rat/MouseInsulin ELISA kit 的具体操作步骤如下）：
A. 将 kit 中提供的 10x Wash buffer 用 MilliQ H2O 稀释到 1x 的工作液。如 50 ml 10x Wash buffer 加入 450 ml Milli Q H2O。
B. 取出合适数量的包被有胰岛素单抗的 ELISA strips 放入板架中，其他剩余的 ELISA strips 放入包装袋中，封好置于 4 ℃ 保存。将 ELISA strips 的每个孔用 300 ul 稀释好的 wash buffer 清洗 3 遍。清洗之后，倒掉 wash buffer，然后在卫生纸上轻轻拍打，以去掉孔中残留的液体。但是注意在进行下一步操作之前，不要使孔完全干掉，以免影响实验结果。
C. 安排好空白对照，标准品，QC 以及样品的加样方式。可能的话，采用复孔的加样方式。
D. 在空白对照的孔中，加入 10 μl Assay Buffer 和 10 μl Matrix Solution；在标准品和 QC 的孔中加入 10 μl 不同浓度的标准品或 QC 和 10μl Matrix Solution，标准品浓度为：10 ng/ml，5 ng/ml，2 ng/ml，1 ng/ml，0.5 ng/ml，0.2 ng/ml；在样品孔中加入 10 μl 所需检测的血清样品和 10 μl Assay Buffer。加样的过程要尽量迅速，防止孔完全干掉。
E. 向每个反应孔中加入 80 μl Detection Antibody。为了得到最好的实验结果，此加样步骤应该在 1 小时内完成。将加样完毕的板架上的 ELISA strips 用封口膜封好，置于脱色摇床上以合适速度轻轻振摇，于室温下孵育 2 小时。
F. 去掉封口膜，倒掉孔中反应的液体，在卫生纸上轻轻拍打，以去掉孔中残留的液体。
G. 将每个反应孔用 300 μl 稀释好的 wash buffer 清洗 3 遍。清洗之后，倒掉 wash buffer，然后在卫生纸上轻轻拍打，以去掉孔中残留的液体。
H. 向每个反应孔中加入 100 μl Enzyme Solution。然后将 ELISA strips 用封口膜封好，置于脱色摇床上以合适速度轻轻振摇，于室温下孵育 30 分钟。
I. 去掉封口膜，倒掉孔中反应的液体，在卫生纸上轻轻拍打，以去掉孔中残留的液体。
J. 将每个反应孔用 300 μl 稀释好的 wash buffer 清洗 6 遍。清洗之后，倒掉 wash buffer，然后在卫生纸上轻轻拍打，以去掉孔中残留的液体。
K. 向每个反应孔中加入 100 ul Substrate Solution，然后用锡箔纸将 ELISA strips 封住，以使每个反应孔避光。置于脱色摇床上以合适速度轻轻振摇，于室温下孵育约 30 分钟。通过和底物的反应，反应孔中的液体会变成蓝色，蓝色的深浅程度与胰岛素的含量呈正比。在此步骤中应随时注意观察颜色的变化，因为蓝色的形成速度根据室温的变化会加快或变慢。根据蓝色变化的快慢应精确控制孵育的时间，可能小于或大于 30 分钟。评判孵育时间的标准，是参考空白对照孔和最低浓度的标准品（0.2 ng/ml）之间的蓝色差异，等到这两个反应孔之间的蓝色深浅出现差异时即可停止孵育。
L. 向每个反应孔中加入 100 μl Stop Solution，用手轻轻拍打板架使液体充分混匀，并去除气泡。这是反应孔中的颜色会由蓝色变成黄色。然后，在 5 分钟中内，用酶标仪读取各个孔在 450 nm 波长下的光吸收值。
M. 用 Excel 软件分析实验结果，根据标准品的浓度值和光吸收数值，取对数值做标准曲线，根据标准曲线换算出检测样品的浓度值。结果示例如图 8-9-9 所示。
注意事项
1. 考虑到血液和尿液中大多数激素的浓度都比较低，其检测需要在专门的实验室内进行。激素含量的检测通常需要大量的血液样品，所以小鼠体内激素水平的检测有一定的难度，小鼠每次仅能抽取 200～300 μl 的血样。
2. 一般情况下，激素水平的检测采用放射免疫法和酶联免疫吸附法。需要强调的是，检测机体内激素水平时，血样的采集必须固定在一时间点上，以避免由于激素分泌的时相性变化带来的数值波动（例如皮质酮的分泌量在每天下午 17 时会高于早晨 8 时）；并且检测前机体禁食时间的长短通常也会影响激素水平的检测值，例如机体胰腺胰岛素的分泌量会着饭后血糖水平的增加而上升；由于许多激素的分泌呈现出脉冲式的变化，例如生长激素和促黄体生成激素，所以这些激素水平的检测需要重复取样来确定。总之，在检测体内激素水平时，所有可能影响测量结果的因素都必须予以考虑。
3. 激素水平的检测除了静态指标的测量外，通常还包括内分泌动态指标的测定，一般来说，这些动态指标的检测涉及一些激素（胰岛素）或者代谢产物（葡萄糖）的水平在一些代谢应激后随时间的变化。例如，在测定卵泡刺激激素和促黄体生成激素指标过程中，注射一定剂量的促黄体生成素释放激素后，血样需要在 0 分钟，20 分钟和 60 分钟几个时间点进行测量。动态指标的测试也被利用在检测机体血糖稳态中，包括高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验，口服葡萄糖耐量试验，腹腔注射糖耐量试验，另一个常见的动态测试是诊断人类库欣综合征的地塞米松抑制测试试验中，血浆中糖皮质激素水平的含量将在单剂量注射地塞米松后的不同时间点进行测量。
4. 血液里胰岛素的测定可以选用血浆或血清进行测定，本章内容我们所采用的是用血清来作为样品，分析其中的胰岛素水平。
来源：丁香实验
