消化法原代培养实验

消化法原代培养实验的基本原理是利用化学与生化的手段，将已剪切成较小体积的动物组织中妨碍细胞生长的间质（基质、纤维等）加以消化，使组织中结合紧密的细胞连接松散、相互分离，形成含单细胞或细胞团的悬液，因单细胞或细胞团易于从外界吸收养分和排出代谢产物，经体外适宜条件培养后，可以得到大量活细胞，在短时间内细胞可生长成片。

器材：

① 新生大鼠

② 眼科剪、眼科镊

③ 培养皿、培养瓶

④ 锥形瓶

⑤ 磁力搅拌器、磁力搅拌棒

⑥ 倒置显微镜

⑦ 恒温箱

⑧ 含 10％ 血清的 DMEM 培养基

⑨ 不锈钢筛网（100 目）

⑩ 离心机

试剂：

① 75% 乙醇

② D-Hanks 液

③ 胰蛋白酶（0.25％）

消化法原代培养实验的基本过程可分为以下几步：（以胰蛋白酶消化为例）

A. 将新生大鼠的肝组织用 D-Hanks 液漂洗 3 次。

B. 用眼科剪、镊将附着在肝组织上的结缔组织去除。

C. 将肝组织剪成 1～2 mm³ 左右的小块，置于锥形瓶中，放入磁力搅拌棒，再注入 30～50 倍组织量的预热到 37 ℃ 的胰蛋白酶液。

D. 在磁力搅拌器上对肝组织块进行搅拌 10～20 min。也可将锥形瓶放入水浴或恒温箱中，每 5 min 摇动 1 次。如消化时间较长，可每隔 5 min 取出 2/3 上清液移入另一离心管，离心后去除胰蛋白酶加入含血清培养基，然后再给原锥形瓶添加新的胰蛋白酶继续消化。

在 4 ℃ 条件下进行冷消化，消化的时间需延长至 12～24 h。如果肝组织块在冷消化一段时间后，可离心再添加胰蛋白酶，放入 37 ℃ 恒温箱中继续温热消化 20～30 min，效果会较好。

E. 吸取少量消化液在倒置显微镜下观察，若组织块已分散成小的细胞团或单个细胞，应立即终止消化。

F. 将消化液和分次收集的细胞悬液通过不锈钢网滤过，除掉未消化充分的大块组织。

G. 将收集的细胞悬液 800～1000 r/min 离心 3～5 min，去除含胰蛋白酶的上清液。

H. 用 D-Hanks 液漂洗 1～2 次，每次 800～1000 r/min 离心 3～5 min，去除上清液。

I. 加入含 10％ 血清的 DMEM 培养基，吹打沉淀制悬，按每 1 mL 5x10⁵～1x10⁶ 个细胞的浓度接种到培养瓶，于 37 ℃ 条件下培养。

1. 进行消化法原代培养实验时，因 Ca^2＋ 和 Mg^2＋ 及血清均具有抑制胰蛋白酶活性的作用，消化过程中使用的所有液体，应均不含有这些离子及血清，消化后可直接加含血清培养基使其灭活。

2. 在选择消化时间时，应考虑到胰蛋白酶的浓度及 pH 值对消化效果的影响，胰蛋白酶常用浓度为 0.25％，pH8～9，消化时温度最好控制在 37 ℃。一般新配制的胰蛋白酶液消化力很强，所以开始用时要注意观察，严格限制消化时间，以免消化过度。

3. 胰蛋白酶主要适用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等组织，但对于纤维性组织和较硬的癌组织的效果差。

4. 由于原代培养过程较长，因此，应严格无菌操作，避免细菌、霉菌等的污染。