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间接免疫荧光技术显示胞质微管

相关实验:胞质微管显示实验

最新修订时间:

简介

微管是真核细胞普遍存在的结构。它是由 a、β 微管蛋白异二聚体和少量微管结合蛋白聚合而成的中空管状纤维。在不同类型的细胞中,微管具有相同的基本形态。微管中的单管在胞质内呈网状或束状分布;二联管构成纤毛、鞭毛的周围部分;三联管构成中心粒以及纤毛、鞭毛基体。观察微管可用电镜和免疫细胞化学技术,其中较常用的有间接免疫荧光法。

原理

间接免疫荧光技术显示胞质微管实验的基本原理是先用抗微管蛋白(tubulin)的免疫血清(一抗)与体外培养细胞一起温育,该抗体与细胞内微管特异结合,然后用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔(IgG)血清(二抗)与一抗温育而结合,从而使微管间接地标上荧光素。在荧光显微镜下,即可看到胞质内伸展的微管网络。间接免疫荧光法除灵敏性高外,它只需要制备一种种属间接荧光抗体,可以适用于多种第一抗体的标记显示,广泛应用于生物大分子的结构定位和形态显示。

材料与仪器

器材:

细胞培养设备、倒置显微镜、荧光显微镜、冰箱、微量加样器(100 μl)、振荡器、铝盒、常规实验器械、体外培养的成纤维细胞。

试剂:


① 0.01 mol/L(pH7.2)磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)


② PEMP 缓冲液


③ 固定液(3.7% 甲醛-PEMD 溶液)


④ 0.5% Triton X-100/PEMP 溶液


⑤ 1% Triton X-100/PBS 溶液


⑥ 兔抗微管蛋白抗体


⑦ 异硫氰酸荧光素 (FITC)-羊抗兔抗体


⑧ 甘油-PBS缓冲液 9:1,pH8.5~9.0)

步骤

间接免疫荧光技术显示胞质微管的基本过程可分为如下几步:

A 把成纤维细胞培养在玻片上,长到十十~十十十时取出。

B 将长有单层细胞的玻片投入 PEMP 缓冲液漂洗。

C 放在预温到 37 ℃ 的 0.5% Triton X-100/PEMP 溶液中,处理 1.5~2 min。

D PEMP 洗 2 次。

E 3.7% 甲醛-PEMD 溶液固定 30 min,室温下。

F pH7.2 的 PBS 洗 2 次,每次 5 min。滤纸吸干余留液体。

G 结合一抗。把长有细胞的一面朝上,平置于盛有 PBS 湿纱布的铝盒内,小心滴加经适当稀释的兔抗微管蛋白抗体 40 μl 于细胞层上,密闭,37 ℃ 温箱中温育 40~60 min。

H 取出玻片,吸去抗体液,放入 35 mm 小染缸内,按下列顺序洗涤:PBS→1% Triton X-100/PBS→PBS,每次 5~10 min。搅拌或放在振荡器上轻轻振荡洗涤,以洗去未结合的抗体。滤纸吸去余留液体,略干燥。

I 结合二抗。在细胞面上滴加 40 μl 经稀释的 FITC-羊抗兔抗体,步骤同(7)。

J 取出玻片,吸去剩余抗体,浸泡漂洗,以洗去未结合的抗体。步骤同(8)。最后过去离子水 2 次

K 略干燥后,滴加甘油-PBS(91)于玻片上,用载玻片封盖。

注意事项

1 每步洗涤要充分,并吸去水分(但不要干透),以免稀释下一步的抗体或试剂,这样才能得到清晰的荧光图像。

2 合适的抗体稀释度。抗体的稀释主要是指“一抗”,因为“一抗”中特异性抗体合适的浓度是关键。“一抗”、“二抗”在使用前应试验最佳稀释度,以特异性染色反应荧光最强,而非特异性染色阴性为佳。

3 孵育时间为 30~60 min,温度常用 37 ℃,该温度可增强抗原-抗体反应,但应在湿盒中进行,防止标本干燥导致失败。

4 标本染色后应立即观察,时间过长荧光会逐渐减弱。标本若放聚乙烯袋中 4 ℃ 保存,可延缓荧光减弱时间,防止固封剂蒸发。

来源:丁香实验

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