简介
真核细胞胞质中纵横交错的纤维网称为细胞骨架。根据纤维直径、组成成分和组装结构的不同分为微管、微丝和中间纤维。目前观察细胞骨架的手段主要有电镜、间接免疫荧光技术、酶标和组织化学等。微丝是肌动蛋白构成的纤维。单根微丝直径约 7 nm，在光学显微镜下看不到。在不同种类的细胞中，它们与某些结合蛋白一起形成不同的亚细胞结构，如肌肉细丝、肠上皮微绒毛轴心和应力纤维等。本实验用考马斯亮蓝 R250（Coomassie brilliant blue R250）显示微丝组成的应力纤维。应力纤维在体外培养的贴壁细胞中尤为发达，与细胞对培养基质的附着和维持细胞扁平铺展的形状有关。
原理
微丝染色及形态观察实验的基本原理是考马斯亮蓝 R250 可以染各种蛋白，并非特异染微丝。但在该实验条件下，微管结构不稳定，有些类型的纤维太细，光学显微镜下无法分辨。因此，我们看到的主要是由微丝组成的应力纤维，直径约 40 nm。
材料与仪器
器材：细胞培养设备、倒置显微镜、恒温箱、显微镜、25 ml 称量瓶、常规实验器械、体外培养的贴壁生长细胞、洋葱鳞茎。
试剂：
① 6 mmol/L PBS（pH6.5）
（A 液：NaH2PO4·2H2O，936 mg/1000 ml。B 液：Na2HPO4·12 H2O，2148 mg/1000 ml。工作液：A 液 68.5 ml＋B 液 31.5 ml（用 NaHCO3 调 pH 至 6.5）
② M 缓冲液（pH7.2）
（咪唑，3.40 g；KCl，3.71 g；MgCl2·6H2O，101.65 mg；EGTA（乙二醇双醚四乙酸），380.35 mg；EDTA（乙二胺四乙酸），29.22 mg；巯基乙醇（mer-captoethanol），0.07 ml；甘油，292 ml；加蒸馏水至 1000 ml（用 1 mol/LHCl 调 pH 至 7.2））
③ 1％ Triton X-100
④ 0.2％ 考马斯亮蓝 R250 染液
⑤ 3％ 戊二醛
步骤
微丝染色及形态观察实验的基本过程可分为如下几步：
（一）动物细胞微丝的显示与观察
A 取材 细胞培养在盖玻片上（为区别细胞的正反面，剪掉一角），生长密度达十十～十十十时取出，细胞面朝上放在称量瓶内，用 6 mmol/LPBS 洗 3 次，每次 1 min。
B 抽提 弃去 PBS 洗液，入 2 ml 1％ Triton X-100，盖上称量瓶盖子，置于垫有湿纱布的铝盒中，放入 37 ℃ 恒温箱处理 25～30 min。
C 冲洗 弃去 1％ Triton X-100，加入 2 ml M 缓冲液轻轻洗细胞 3 次，每次 2 min。M 缓冲液有稳定细胞骨架的作用。
D 固定 略晾干后，加入 2 ml 3％ 戊二醛，固定细胞 15 min。
E 冲洗 弃去固定液，用 6 mmol/L PBS 轻轻洗 3 次，每次 2 min。
F 染色 弃去洗液，把小盖片立于吸水滤纸上，吸去标本边缘水分。加入 2 ml 0.2％ 考马斯亮蓝 R250 染色 20 min。
G 冲洗 用蒸馏水轻轻洗去标本上的染液，滤纸吸干标本边缘水分，空气干燥，直接观察或树脂封片。
（二）植物细胞微丝的显示与观察
A 取材 用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮，大小约 1 c㎡，放入盛有 6 mmol/L PBS 的称量瓶中，使其下沉，处理 5～10 min。
B 抽提 弃去 PBS，加入 2 ml 1％ Triton X-100，盖上称量瓶盖子，置于垫有湿纱布的铝盒中，放入 37℃ 恒温箱中处理 30 min。
C 冲洗 弃去 1％ Triton X-100，加入 2 ml M 缓冲液轻轻洗洋葱内表皮，每次 3～5 min，共 3 次。
D 固定 加入 2 ml 3％ 戊二醛固定 20 min。
E 冲洗 弃去固定液，加入 2 ml 6 mmol/L PBS 轻轻洗洋葱内表皮，每次 3～5 min，共 3 次，吸水滤纸吸去残液。
F 染色 加入 2 ml 0.2％ 考马斯亮蓝 R250 染色 20 min。
G 制片 弃去染液，用蒸馏水轻轻洗 3 次。把标本平铺在载玻片上，加盖玻片。镜检。
注意事项
1 沿称量瓶内壁缓慢加入各种试剂，避免直接滴落在盖片上；洗细胞动作要轻，避免细胞脱落。
2 抽提、固定及染色须在加盖的称量瓶中进行，并且盖玻片的细胞面始终朝上。
3 用 1％ Triton X-100 抽提杂蛋白和脂类要做预实验，抽提时间长将破坏细胞结构，抽提时间短背景干扰大。
4 应力纤维是一种动态结构，细胞充分贴壁铺展时纤维挺拔、丰富；反之，细胞收缩变圆，应力纤维弯曲，甚至部分解聚消失而显稀少。
来源：丁香实验
