细胞中的微丝染色及微丝与细胞形态的观察实验

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【实验目的】
掌握微丝的染色方法，了解光学显微镜和电子显微镜 下微丝的基本形态结构。
【实验用品】
一、材料和标本 盖片培养的成纤维细胞三片。
二、器材和仪器 光学显微镜一台、镊子一把、小平皿六个、载片三个、吸水纸、37℃恒温箱。
三、试剂 PBS (pH7.2)、2％Triton X—100液、M—缓冲液、3％戊二醛固定液、0.2％考马斯亮兰染液、100μg／ml的细胞松驰素B、DMEM培养液。
【实验内容】
一、成纤维细胞微丝的染色及其对细胞松驰素B的反应
(一)原理
微丝普遍存在于多种细胞，对细胞的形状和运动有一定作用。细胞松驰素B可与微丝的亚单位肌动蛋白结合，从而破坏微丝，改变细胞的形状。
(二)细胞松驰素B处理成纤维细胞与染色观察
1．在平皿中有三张成纤维细胞贴壁生长的盖片，在超净工作台内将一张盖片移入另一皿中继续培养，用作对照。
2．在有两片的平皿内加100μg／ml的细胞松弛素B 4滴继续培养半小时。
3. 将用细胞松弛素B处理过的两张盖片取一张做染色处理，另一张用培养液洗五次（在平皿内换五次培养液，每次都要摇动），继续培养、观察。两小时后细胞形状恢复，接近正常。
4．对恢复的盖片与第一张没用药的盖片一同做染色处理。
5．染色处理
①将需染色的盖片放入盛有PBS的平皿内用吸管轻轻吹洗盖片，换液三次，每次3分钟，洗去培养液。
②将盖片移入2％Triton X一100液，置37℃恒温箱内处理20～30分钟，以提取骨架以外的蛋白质，使骨架图像清晰。
③立刻将盖片移入M一缓冲液，换洗三次，每次3分钟。M一缓冲液有稳定细胞骨架的作用。
④将盖片移入3％戊二醛固定15分钟。
⑤将盖片移入0.2％考马斯亮兰染液中，染色15分钟。然后小心地用自来水冲洗，空气干燥。
(三)结果
光镜观察，微丝聚集成的张力纤维束被染成蓝色。在没用药的标本上，成纤维细胞多数有突起，微丝沿突起规则排列；用细胞松驰素B处理的标本，由于微丝被破坏突起缩回，多数细胞形状变圆；用药处理后又洗去药的标本，由于解除了药的作用，肌动蛋白重新聚台形成微丝，细胞形状恢复正常。
二、丽藻细胞内胞质环流及其对细胞松弛素B的反应
(一)原理
丽藻细胞大，整个细胞的中央为大液泡占据。靠近液泡是一层溶胶样流动的内质，在内质与质膜之间，为静止的外质，其中含有叶绿体 。内质中含有许多颗粒，可以清楚地看到胞质环流。在丽藻细胞中的微丝与胞质环流有密切关系。成束的微丝出现在外质与内质接口(溶胶和凝胶接口)并交织一起，与环流方向平行。用细胞松弛素B处理后，就可抑制胞质的环流运动。
(二)方法
1．剪下一小块丽藻叶片(1～2cm)，置于载片上，盖上盖片。
2．观察（阳光充足时效果较好）。
3．再取一块丽藻叶片，滴一滴细胞松弛素B，10~15分钟后盖上盖片，观察。
4．洗去药物，再观察。
(三)结果
在丽藻内质中可以看到胞质环流，用细胞松弛素B处理后，胞质环流停止，洗去药物，又出现胞质环流。
三、微丝的电镜照片观察
恒河猴脊髓内神经纤维中微丝电镜照片，可见微丝是实心结构，直径5～8cm，它均匀地分散于细胞基质中，或排列成束和网状。