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通过RNA酶保护分析法进行液相杂交

相关实验:核酸分子液相杂交实验

最新修订时间:

简介

RNA 酶保护分析法(RNase protection assayRPA)的原理与核酸酶 S1 保护分析法基本相同,只是所采用的探针为单链 RNA 探针,杂交后形成 RNARNA 双链。RNA A RNA T1 专一性降解单链 RNA,而双链 RNA 则不被降解。此法的灵敏度较核酸酶 S1 保护分析法还要高出数倍,可用于 RNA 定量、RNA 末端定位及确定内含子在相应基因中的位置。

原理
RNA酶保护分析法的基本原理是利用单链 RNA 探针,与待测的 RNA样品进行杂交形成 RNA:RNA 双链分子,由于 RNA 酶可专一性地降解未杂交的单链 RNA,而双链受到保护不被降解,经凝胶电泳可以确定目的 RNA 的长度。
用途
RNA 酶保护分析法可用于 RNA 定量、RNA 末端定位及确定内含子在相应基因中的位置。


材料与仪器

试剂:
1. GACU POOL:取100 mMATPCTPGTP2.78 μl100 mM UTP 0.06 μl,加 DEPC H2O 100 μl
2. 杂交缓冲液
IPES 0.134 g0.5 M EDTApH8.020 μl5 M NaCl 0.8 ml、甲酰胺 8 ml,加 DEPC H2O 10 ml
3. RNase 消化液:5 M NaCl 120 μl1 M Tris-HClpH7.420 μl0.5 M EDTApH 8.020 μlRNase A10 mg/ml8 μlRNase T1250 U/μl1μl,加DEPC H2O 2 ml
仪器:
离心机、水浴锅、电泳仪、


步骤


RNA 酶保护分析法的基本过程可分为如下几步:

1.反义 RNA 可由含T7SP6启动子的重组质粒为模板制备,也可以用含启动子的 PCR 产物为模板制备,本文介绍后者:


(1)设计含 T7 启动子的 PCR 引物:由于 PCR 产物将作为合成反义 RNA 的模板,所以一对引物中的下游引物 5-端要含 T7 启动子序列:

T7 启动子序列为:5-TAATACGACTCACTATAGGG

引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。PCR 产物的长度决定了反义 RNA 探针的长度,具体设计时可考虑 100-400bp 长。最好采用巢式 PCR,即先扩增出一较长的片段,再以该片段为模板扩增出较短的片段,以保证探针的特异性。


(2)PCR:先用上游引物和下游引物Ⅰ进行 PCR,再以 PCR 产物为模板,用上游引物和下游引物 Ⅱ-T7进行二次 PCR


(3)探针合成标记与纯化:在 0.5ml 离心管中加入下列试剂:

RNasin (40 U/μl0.5 μlGACU POOL GAC、DTT (二硫苏糖醇,0.1 M1 μl5×转录 buffer 2 μl、模板(50 ng/μl1 μlT7 RNA 聚合酶 (15 U1 μl,混合后,短暂离心,37℃ 保温 1h

加入 DNaseⅠ(10 U/μl1 μl3715 min, 然后 75 10 min 以灭活 DNAseⅠ和 T7 RNA 聚合酶。加入:饱和酚 50 μl/、氯仿 50 μl、酵母 tRNA2 μg/μl4 μlDEPC H2O 100 μl,室温下充分混匀,离心 10 000 g×2 min

取上层液置另一 0.5 ml 离心管中,加入 100 μl 氯仿,混匀,离心10 000 g×2 min。将上层液转移至另一 0.5 ml 离心管中,再加入 3 M NaAc 10 μl、预冷无水乙醇 250 μl,混匀后,-20℃ 静置 30 min

4℃ 离心 13500 g×10 min。弃上清液,沉淀用 75% 乙醇100 μl洗涤,4℃离心 13500 g×2 min, 弃上清液。室温下挥发残留乙醇。

加入 50 μl 杂交缓冲液溶解沉淀,4℃ 下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。

2.杂交

(1) RNA 提取后溶解在杂交缓冲液中,浓度为1 μg/μl


(2)取8μl RNA 加入 1-3 μl探针(根据探针检测结果调整)于 0.5 ml 离心管中。


3) 80℃ 保温 2 min,然后 40-45℃ 下杂交 12-18 hr


3. 消化

(1) 杂交管于 37 ℃ 保温 15 min,加入 RNase 消化液,37 ℃ 保温 30 min


(2) 加入 10% SDS 10 μl10 μg/μl 蛋白酶 K 20 μl,混匀,37 ℃ 保温 10 min


(3) 加入 65 μl饱和酚和 65 μl 氯仿,混匀,室温离心,10 000 g×2 min


(4) 转移上层液到另一 0.5 离心管中,加入10 μl 酵母 tRNA 3 M NaAc 15 μl,再加入 200 μl 异丙醇,混匀后,置 -2030 min4 ℃ 离心,135 000 g×10 min


(5) 弃上清液,室温下挥发乙醇,加入5-8 μl 上样缓冲液溶解沉淀。

4、电泳与放射自显影
(1)配制凝胶:(50 ml
40% 丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺(1916.25 ml5×TBE 10 ml、尿素 24 g,

加H2O 至 50 ml,溶解后加入 25% 过硫酸胺 50 μlTEMED 50 μl,混匀,注入电泳槽中,插入梳,待胶凝固。


(2)预电泳

以1×TBE 为上下槽电泳缓冲液,加上电压后进行预电泳,如果用测序电泳装置,电压应达 2 000 v 以上,功率设定为 100 w,温度设为 50℃。待胶板温度达 50℃ 时,暂停电泳,准备加样。


(3)加样

将已溶解在加样缓冲液中的样品 80℃加热 2 min,立即加样到胶孔中,电泳 1-2h(电泳条件同预电泳)。


(3) 电泳结束后,打开胶板,用滤纸取下胶,覆上一层保鲜膜,放置于暗盒中,暗室红光下,压上一张 X 片,盖上暗盒,-70℃ 曝光 1-3天。暴光结束后,将 X 光片显影、定影、水洗、晾干。


来源:丁香实验

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