通过RNA酶保护分析法进行液相杂交

RNA 酶保护分析法（RNase protection assay， RPA）的原理与核酸酶 S1 保护分析法基本相同，只是所采用的探针为单链 RNA 探针，杂交后形成 RNA／RNA 双链。RNA 酶 A 和 RNA 酶 T1 专一性降解单链 RNA，而双链 RNA 则不被降解。此法的灵敏度较核酸酶 S1 保护分析法还要高出数倍，可用于 RNA 定量、RNA 末端定位及确定内含子在相应基因中的位置。

1.反义 RNA 可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的 PCR 产物为模板制备，本文介绍后者：

T7 启动子序列为：5’-TAATACGACTCACTATAGGG

引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。PCR 产物的长度决定了反义 RNA 探针的长度，具体设计时可考虑 100-400bp 长。最好采用巢式 PCR，即先扩增出一较长的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性。

（2）PCR：先用上游引物和下游引物Ⅰ进行 PCR，再以 PCR 产物为模板，用上游引物和下游引物 Ⅱ-T7进行二次 PCR。

（3）探针合成标记与纯化：在 0.5ml 离心管中加入下列试剂：

加入 DNaseⅠ（10 U/μl）1 μl， 37℃ 15 min， 然后 75 ℃ 10 min 以灭活 DNAseⅠ和 T7 RNA 聚合酶。加入：饱和酚 50 μl/、氯仿 50 μl、酵母 tRNA（2 μg/μl）4 μl、DEPC H2O 100 μl，室温下充分混匀，离心 10 000 g×2 min。

取上层液置另一 0.5 ml 离心管中，加入 100 μl 氯仿，混匀，离心10 000 g×2 min。将上层液转移至另一 0.5 ml 离心管中，再加入 3 M NaAc 10 μl、预冷无水乙醇 250 μl，混匀后，-20℃ 静置 30 min。

4℃ 离心 13500 g×10 min。弃上清液，沉淀用 75% 乙醇100 μl洗涤，4℃离心 13500 g×2 min， 弃上清液。室温下挥发残留乙醇。

加入 50 μl 杂交缓冲液溶解沉淀，4℃ 下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。

（1） RNA 提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为1 μg/μl。

（2）取8μl RNA 加入 1-3 μl探针（根据探针检测结果调整）于 0.5 ml 离心管中。

（3） 80℃ 保温 2 min，然后 40-45℃ 下杂交 12-18 hr。

（1） 杂交管于 37 ℃ 保温 15 min，加入 RNase 消化液，37 ℃ 保温 30 min。

（2） 加入 10% SDS 10 μl、10 μg/μl 蛋白酶 K 20 μl，混匀，37 ℃ 保温 10 min。

（3） 加入 65 μl饱和酚和 65 μl 氯仿，混匀，室温离心，10 000 g×2 min。

（4） 转移上层液到另一 0.5 离心管中，加入10 μl 酵母 tRNA 和 3 M NaAc 15 μl，再加入 200 μl 异丙醇，混匀后，置 -20℃ 30 min，4 ℃ 离心，135 000 g×10 min。

（5） 弃上清液，室温下挥发乙醇，加入5-8 μl 上样缓冲液溶解沉淀。

加H₂O 至 50 ml，溶解后加入 25% 过硫酸胺 50 μl，TEMED 50 μl，混匀，注入电泳槽中，插入梳，待胶凝固。

以1×TBE 为上下槽电泳缓冲液，加上电压后进行预电泳，如果用测序电泳装置，电压应达 2 000 v 以上，功率设定为 100 w，温度设为 50℃。待胶板温度达 50℃ 时，暂停电泳，准备加样。

将已溶解在加样缓冲液中的样品 80℃加热 2 min，立即加样到胶孔中，电泳 1-2h（电泳条件同预电泳）。