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通过核酸酶 S1 保护分析法进行液相杂交

相关实验:核酸分子液相杂交实验

最新修订时间:

简介

核酸酶 S1 保护分析法(nuclease S1 protection assay)是一种检测 RNA 的杂交技术,又称为 S1-描图(S1-mapping)。其灵敏度较之 Northern 杂交法更高,并可进行较为准确的定量。选择适当的探针还可进行基因转录起始位点分析及内含子剪切位点分析等。

原理

核酸酶 S1 保护分析法的基本原理是利用 M13 噬菌体体系合成高比放射活性的单链 DNA 探针,探针与待测RNA样品在液相中进行杂交,形成 DNARNA 杂交双链。核酸酶 S1 能专一性降解没有形成杂交体的 DNA RNA 单链,而 DNARNA 杂交双链则受到保护而不被降解。


材料与仪器

试剂:
酵母 tRNA、乙醇、80%去离子化甲酰胺,0.4mol/L NaCl,40mmol/L PIPES(pH 6.4),1mmolL EDTApH 8.0)、核酸酶 S1280mmolL NaCl50mmolL 乙酸钠(pH4.5),4.5mmolL ZnSO,,20μgml 变性鲑精 DNA、电泳上样缓冲液
仪器:
水浴锅、电泳仪


步骤

核酸酶 S1 保护分析法的基本过程可分为如下几步:
1.加入适量 RNA 样品(1015μg)于微量离心管中,并补加适量酵母 tRNA RNA 总量为25μg
2.加入适量标记的单链DNA探针(约50000cpm)于上述 RNA 混合物中,乙醇沉淀后弃上清。沉淀于室温干燥,然后加入相应杂交缓冲液[80%去离子化甲酰胺,0.4mol/L NaCl,40mmol/L PIPES(pH 6.4),1mmolL EDTApH 8.0)]30μl,重新溶解核酸沉淀,混匀。将离心管完全浸没于85℃水浴中,保温15min
3.迅速将离心管转入 52℃ 水浴中保温12h
D.加入 30μl 330U 核酸酶S1的酶解缓冲液[280mmolL NaCl50mmolL乙酸钠(pH4.5),4.5mmolL ZnSO,,20μgml变性鲑精DNA],并置于 37℃ 水浴中保温 30min
4.酶解完毕后,加入 75μl 终止缓冲液及 750μl 冰预冷的 95%乙醇 。酚/氯仿抽提 1 次,最后用 2 倍体积无水乙醇沉淀,置 -70℃ 过夜。
5.此样品溶解于 10μl 电泳上样缓冲液并经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。然后放射自显影,阅读相应区带的有无及强弱,判断 DNA 探针所针对的 RNA 序列的有无及量的多少。


来源:丁香实验

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