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核酸分子液相杂交实验

实验分类:

RNA 实验

最新修订时间:

简介

核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)技术是分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一。核酸分子杂交依据被分析样品的性质不同可以分为液相杂交与固相杂交两种。液相杂交中参加反应的两条核酸单链都游离在液体中,属于液相杂交的有核酸酶 S1 保护分析、RNA 酶保护分析、引物延伸分析等方法。


原理

核酸分子杂交的基本原理是两条互补核酸单链 DNA 或 RNA 在一定条件下(适宜的温度及离子强度)可按碱基互补配对的原则退火形成双链分子(DNA/DNA、DNA/RNA 或 RNA/RNA),由此可检测核酸分子的存在与否。杂交的双方是待测的核酸序列及探针,杂交后形成的异质双链分子称为杂交分子或杂交双链。由于杂交是在分子水平上进行的,故称为分子杂交。


应用

由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性,使得它在分子生物学领域中被广泛应用,常被应用于基因克隆的筛选和酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定量和定性分析、基因突变分析以及疾病的诊断等。


来源:《医学分子生物学实验技术》药立波第3版第6章

操作方法

通过核酸酶 S1 保护分析法进行液相杂交

核酸酶 S1 保护分析法(nuclease S1 protection assay)是一种检测 RNA 的杂交技术,又称为 S1-描图(S1-mapping)。其灵敏度较之 Northern 杂交法更高,并可进行较为准确的定量。选择适当的探针还可进行基因转录起始位点分析及内含子剪切位点分析等。原理核酸酶 S1 保护分析法的基本原理是利用 M13 噬菌体体系合成高比放射活性的单链 DNA 探针,探针

通过RNA酶保护分析法进行液相杂交

RNA 酶保护分析法(RNase protection assay, RPA)的原理与核酸酶 S1 保护分析法基本相同,只是所采用的探针为单链 RNA 探针,杂交后形成 RNA/RNA 双链。RNA 酶 A 和 RNA 酶 T1 专一性降解单链 RNA,而双链 RNA 则不被降解。此法的灵敏度较核酸酶 S1 保护分析法还要高出数倍,可用于 RNA 定量、RNA 末端定位及确定内含子在相应基因中

通过引物延伸分析法进行液相杂交

引物延伸分析法(primer extension analysis)可用于 RNA5'-端的定位和定量,并可检测 mRNA 的前体和剪接加工中间体。采用引物延伸分析法时,单链 DNA 引物一般为 30~40nt 长度的合成寡核苷酸。这种引物有两个主要优点:①不能形成 DNA:DNA 杂交体;②其序列可以精心设计,以便与特定的 mRNA 序列杂交。采用这种方法可以避免 mRNA 二级结构所造成的

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