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RNA酶保护试验(RPA)

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一、RNA酶保护试验(RPA)

RNA酶保护试验((RNase Protection Assay,RPA)即糖核酸酶保护实验(Ribonuclease protection assay,RPA)是近十年发展起来的一种全新的mRNA定量分析方法。本文主要介绍了核糖核酸酶保护分析实验的从试剂准备到、操作步骤以及实验结果全部的操作流程,供大家分享。

二、材料准备及操作步骤

试剂准备

1. GACU POOL:取100 mM ATP、CTP、GTP各2.78 μl、100 mM UTP 0.06 μl,加DEPC H2O至100 μl。

2. 杂交缓冲液

IPES 0.134 g、0.5 M EDTA(pH8.0)20 μl、5 M NaCl 0.8 ml、甲酰胺8 ml,加DEPC H2O至10 ml。

3. RNase消化液:5 M NaCl 120 μl、1 M Tris-HCl(pH7.4) 20 μl、0.5 M EDTA(pH 8.0)20 μl、RNase A(10 mg/ml) 8 μl、RNase T1(250 U/μl) 1μl,加DEPC H2O至2 ml。

操作步骤

1.反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备,也可以用含启动子的PCR产物为模板制备,本文介绍后者。

(1)设计含T7启动子的PCR引物

由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板,所以一对引物中的下游引物5’-端要含T7启动子序列:

T7启动子序列为:5’-TAATACGACTCACTATAGGG

引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度,具体设计时可考虑100-400bp长。最好采用巢式PCR,即先扩增出一较长的片段,再以该片段为模板扩增出较短的片段,以保证探针的特异性。

(2)PCR:先用上游引物和下游引物Ⅰ进行PCR,再以PCR 产物为模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7进行二次PCR。

(3)探针合成标记与纯化

在0.5ml 离心管中加入下列试剂:

RNasin (40 U/μl) 0.5 μl

GACU POOL GAC

(含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61 μM) 2 μl

[α-32P]UTP(10 μCi/μl) 2.5 μl

DTT (二硫苏糖醇,0.1 M) 1 μl

5×转录 buffer 2 μl

模板(50 ng/μl) 1 μl

T7 RNA 聚合酶 (15 U) 1 μl

混合后,短暂离心,37℃保温1 hr。

加入DNaseⅠ(10 U/μl)1 μl, 37℃ 15 min, 然后75 ℃ 10 min以灭活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。

加入:饱和酚 50 μl

氯仿 50 μl

酵母tRNA(2 μg/μl) 4 μl

DEPC H2O 100 μl

室温下充分混匀,离心10000 g×2 min。取上层液置另一0.5 ml离心管中,加入100 μl氯仿,混匀,离心10000 g×2 min。将上层液转移至另一0.5 ml 离心管中,再加入3 M NaAc 10 μl、预冷无水乙醇250 μl,混匀后,-20℃静置30 min。4℃离心13500 g×10 min。弃上清液,沉淀用75%乙醇100 μl洗涤,4℃离心13500 g×2 min, 弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入50 μl杂交缓冲液溶解沉淀,4℃下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。

2.杂交

(1) RNA提取后溶解在杂交缓冲液中,浓度为1 μg/μl。

(2)取8μl RNA加入1-3 μl探针(根据探针检测结果调整)于0.5 ml 离心管中。

(2) 80℃保温2 min,然后40-45℃下杂交12-18 hr。

3. 消化

(1) 杂交管于37 ℃保温15 min,加入RNase消化液,37 ℃保温30 min。

(2) 加入10%SDS 10 μl、10 μg/μl蛋白酶K 20 μl,混匀,37 ℃保温10 min。

(3) 加入65 μl饱和酚和65 μl氯仿,混匀,室温离心,10000 g×2 min。

(4) 转移上层液到另一0.5离心管中,加入10 μl 酵母tRNA和3 M NaAc 15 μl,再加入200 μl 异丙醇,混匀后,置-20℃ 30 min,4 ℃离心,135000 g×10 min。

(5) 弃上清液,室温下挥发乙醇,加入5-8 μl 上样缓冲液溶解沉淀。

4、电泳与放射自显影

(1)配制凝胶:(50 ml)

40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺(19:1) 6.25 ml

5×TBE 10 ml

尿素 24 g

加H2O至50 ml

溶解后加入25%过硫酸胺50 μl,TEMED 50 μl,混匀,注入电泳槽中,插入梳,待胶凝固。

(2)预电泳

以1×TBE为上下槽电泳缓冲液,加上电压后进行预电泳,如果用测序电泳装置,电压应达2000 v以上,功率设定为100 w,温度设为50℃。待胶板温度达50℃时,暂停电泳,准备加样。

(3)加样

将已溶解在加样缓冲液中的样品80℃加热2 min,立即加样到胶孔中,电泳1-2 hr。(电泳条件同预电泳)。

(3) 电泳结束后,打开胶板,用滤纸取下胶,覆上一层保鲜膜,放置于暗盒中,暗室红光下,压上一张X片,盖上暗盒,-70℃曝光1-3天。暴光结束后,将X光片显影、定影、水洗、晾干。

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