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紫外光谱吸收法测定蛋白质总含量

相关实验:基于蛋白质光吸收特性测定蛋白质总含量

最新修订时间:

简介

蛋白质的定量可以用物理测定方法进行。紫外光谱吸收法(ultraviolet spectrometry)可以简单、快速地检测出样品溶液中的蛋白含量。


原理

紫外光谱吸收法基本原理是蛋白质在紫外区有两个吸收峰。一个吸收峰在 280nm 处,是由蛋白质中芳香族氨基酸的色氨酸和酪氨酸分子中苯环的共轭双键引起的,其中色氨酸的光吸收最强,酪氨酸次之。大部分蛋白质中的芳香族氨基酸含量差别不大,故可以用溶液在 280nm 处的吸光度推算出蛋白含量。相对纯化的、无核酸污染的蛋白溶液紫外光吸收比值(A280A260)约为 1.8,如此值过低,表明有较多核酸杂质存在。蛋白质在紫外区的另一吸收峰是由肽键引起的,在 240nm 以下时光密度急剧增加,215nm 处的吸收率为280nm处的数倍。对含量很低的蛋白质溶液可以用 215nm 处的吸光度和 225nm 处的吸光度之差来测定蛋白质含量。


用途

紫外光谱吸收法主要用于蛋白质的快速含量检测,此时对蛋白质的定性需求高于准确定量需求。例如在蛋白质纯化过程中,尤其是各种层析纯化过程中监测蛋白质的位置,判断吸附和洗脱情况。另外,对于一些准确度要求不高的蛋白质定量实验,也可以用紫外光谱吸收法估测溶液中的蛋白质含量。


材料与仪器

器材:紫外分光光度计、石英比色杯
试剂:
已知蛋白含量的标准品溶液


步骤

紫外光谱吸收法测定蛋白质总含量基本过程可分为如下几步:

A. 取一定体积适当稀释的蛋白质溶液,放入石英比色杯内,在紫外分光光度计上读取相应波长处的吸光度。吸光度读数应该在 0.1 到 0.8 之间,低于或高于此范围都会产生较大的误差。

B. 用吸光度读数计算溶液中蛋白质含量的方法有两种。一种根据已知蛋白含量的标准品溶液的紫外吸收光密度值,作出标准曲线,将样品与标准曲线相比即可计算出其蛋白质含量。另一种方法是根据溶液的 A280/A260 比值,用以下经验公式估算出蛋白质含量:

蛋白质浓度(mg/ml)=1.45xA280-0.74xA260


注意事项

1. 应用紫外光谱吸收法测定蛋白质含量时必须注意,用于仪器调零的液体要与待测样品一致,标准蛋白也需要使用同样的溶剂,以避免溶剂的紫外吸收特性干扰样品测定。表 10-2 汇总了几种蛋白质含量测定方法的部分特征数据,可根据具体情况选用。


来源:丁香实验

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