流式细胞术分析测定细胞可溶性蛋白质含量

流式细胞术分析测定细胞可溶性蛋白质含量的基本原理是将待测细胞被制成单细胞悬液，经特异性荧光染料或者含有荧光染料标记的抗体染色后加入样品管中。细胞进入流动室，在液压下单列排列形成单细胞流，与水平方向的激光光束垂直相交，被标记的细胞在激光下发出特定波长的荧光、能够为光电倍增管检测到，根据荧光强度以及荧光类型对细胞中蛋白表达水平进行定量分析。

流式细胞术分析测定细胞可溶性蛋白质含量基本过程可分为如下几步：

A. 细胞的收集与固定：将待测细胞彻底弃去培养液，用 PBS 清洗；加入消化液消化细胞，血清终止反应；收集细胞悬液，4℃、100g 离心 10 分钟，离心前留出小部分细胞进行细胞计数；离心结束后，弃去上清，将细胞重悬于 100μl PBS 中，随后加入 900 μl 预冷（-20℃）的甲醇固定细胞，并将细胞保存于 -20℃。

B. 第一抗体结合：将 1.5 x 10⁶ 个上述固定的细胞转移至新的微量离心管中，于 4000g 离心 15 秒，收集细胞；弃去固定液，用 1.0 ml 4℃ 预冷的 PBS 重悬细胞，重复上述离心步骤；去除 PBS ，加入 0.5 ml 针对目的蛋白的第一抗体工作液，轻柔振荡混匀。将细胞与抗体于 4℃ 孵育过夜。

C. 染色：4000g 离心 15 秒，收集细胞，弃去抗体孵育液。用 0.5 ml PBS（含 10％ 灭活正常山羊血清、0.0002％ Triton X-100和0.01％NaN₃）重悬细胞沉淀，并轻柔混匀再离心重悬细胞以洗去未结合的第一抗体，重复洗涤 3 次；向细胞沉淀中加入 0.5 ml FITC 标记的第二抗体并轻柔混匀，37℃ 孵育 2 小时，期间间断性轻柔混匀并尽可能避光；重复洗涤步骤 2～3 次，并弃去上清；向细胞沉淀中加入 0.5 ml RNA 酶并轻柔混匀，37℃ 孵育 30 分钟。

1. 所有的液体溶液和试剂都应通过高压消毒或者过滤除菌的方式灭菌，并无菌保存。

2. 消化收集细胞时仔细控制细胞消化时间，避免细胞成团

3. 每个样品的起始细胞数至少为 1.5 x 10⁶，在固定和染色过程中会损失一些细胞，最后上机检测时细胞数大约为 1.0 x 10。减小离心管容积，并使用聚丙烯管能够减少细胞流失。

4. 清洗溶液中可加入山羊血清以降低抗体的非特异性结合。