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SB转座子系统诱变基因组

相关实验:利用转座子系统诱变基因组

最新修订时间:

简介

转座子(transposon)是一类可在基因组中发生位置移动的 DNA 片段,其移动过程被称为转座(transposition)。根据转座机制的不同,转座子可分为反转录转座子和 DNA 转座子两类,其中 DNA 转座子具有可被人为改造以及在哺乳动物中高效转座的优势而被广泛采用。常用的 DNA 转座子包括 Sleeping Beauty(SB)、piggyBac(PB)和 Tol2 等。利用转座子可携带较大的外源基因片段在动物体内实现高效转座的特点,解决了转基因动物制备时基因整合率低、表达效率低、随机整合、制作成本高等技术瓶颈问题,从而成为研究小鼠基因功能的常用手段。


方法原理


转座子系统诱变基因组的基本原理是首先将转座子整合入基因组并造成相应的基因突变体,再从中筛选出具有某种特异表型的细胞或个体,进一步通过反式 PCR 技术检测转座子的插入位点,从而研究被突变基因的功能。基因组中的蛋白编码序列只有 2% 左右,单纯的转座子插入有可能插入内含子而不引起表型变化,因此通常采用基因捕获技术 (gene trapping),即在转座子载体的基础上加入启动子、报告基因、剪接供体 (splicerlonor,SD)、剪接受体 (spliceacceptor,SA) 和 polyA 加尾信号等元件,这样可显著提高基因突变体的筛选效率。通过高通批的基因捕获技术与各种转座子及报告基因的联合应用,可以构建全基因组范围的小鼠胚胎干细胞基因突变体文库,为大规模的基因功能研究提供良好的公共资源基础。


SB 转座子系统:SB 转座子系统具有高效、随机整合的特点,可用于小鼠基因组的大规模突变。旧版的 SB 转座子(含有 CAG-GFP) 只能检测转座事件;而新版的转座子利用启动子捕获和 polyA 捕获的原理,可以筛选出发生在内源基因内部的转座事件,并可以确定该内源基因的表达谱。


方法用途


DNA 转座子常用于制作转基因动物、基因治疗、细胞及整体水平的基因功能研究等领域。与病毒载体相比,转座子具有整合位点广泛、安全性高、可精确进行插入和切除、易于检测和控制等优点,结合基因捕获和 Cre-loxP 位点特异性重组等技术,可进行大规模的转基因动物制作和功能基因筛选,具有广阔的应用前景。基于转座子的大规模小鼠胚胎干细胞突变体库的建立,克服了传统基因打靶技术实验条件和技术水平等的限制,有效地促进了基因功能研究的广泛开展。在基因治疗方面,转座子具有精确、稳定、安全的整合特性,有望替代病毒载体而成为基因治疗的首选载体。


材料与仪器

试剂:

小鼠、


仪器:
培养箱、注射器、离心机等


步骤

SB 转座子转基因小鼠的建立目前已有一些 SB 转座子转基因小鼠品系可以购买,如 CAGGS-SBO/+小鼠、Prml-SB10/+小鼠和 Rosa26-SB11 小鼠等。如果自行构建,则需要进行以下实验:


1.(1) 用常规的 DNA 重组方法构建转座子载体。一般应包括基因捕获组分,如拼接受体和 polyA 加尾序列,以便在插入内含子时破坏基因的功能。在设计转座子载体时应该充分考虑到后续表型分析时如何将基因型与表型相关联。如果转座子插入到功能基因的内含子,可以通过再次转座从基因中切离转座子,使表型回复。但目前使用的 SBIO 或 S81I 转座酶转基因的再切离活性很低,而胚胎干细胞操作很复杂而且需要专门设备,因此建议使用 Cre-LoxP 系统或者 FLP-Frt 系统。这样,在设计转座子载体时需要在基因捕获单元两侧加入 LoxP 或 Frt 位点,只要使用表达重组酶 Cre 或 FLP 的转基因小鼠就可以回复转座子插入突变。另外还需注意,SB 转座子对转座子载体的长度很敏感,所以插入序列最好小于 10kb。


(2) 转座子转基因小鼠通过常规的雄前核注射的方法产生,或者可以通过商业途径或合作获得以往构建的转座子转基因小鼠。在使用转座子载体构建转基因小鼠时,载体首先要被线性化或从载体上将转座子序列回收后用于注射。以往的研究发现,在注射时最好保留载体上的质粒序列,这些质粒序列在整合位点可以被甲基化,从而促进下一步的转座插入。此外,质粒序列还可以被用于基因型鉴定,质粒中含有的酶切位点可以被用于转座插入位点克隆时去除转座子供体位点的序列。


(3) 用 Southern 杂交确定不同转基因初建小鼠 (founrler) 的转基因拷贝数。在后续实验中,由于小鼠品系之间的差别,应该测试几个不同的中等拷贝数和高拷贝数的初建品系的转座效率。


2. 双转基因「种子」小鼠的产生将各个转基因品系分别与 SB 转座酶转基因小鼠交配,以获得双转基因的雄性」种子小鼠"。取多个「种子」小鼠与野生型雌性小鼠交配,取子代小鼠尾巴 DNA 进行 Southern 杂交,检测有无新的转座插入。一旦选定用于进一步分析的「种子小鼠」,应收集尽量多的带有转座子插入的子一代小鼠,用于后续的表型和基因功能分析。


3. 子一代小鼠的产生和分析可以采用启动子捕获或 polyA 捕获报告基因的表达筛选子一代小鼠的转座插入,或者直接从子一代小鼠克隆新的转座子插入。如果转座比率足够高,也可以不克隆转座插入,而是直接从子一代和子三代小鼠直接进行表型筛选。这种「正向遗传学」方法需要很高的转座率,但最终获得的转座插入突变体都需要分子生物学方法的确认。转座酶的存在可能使转座子重新移动,造成转座子诱导的插入突变或转座子供体位置的基因组重排和缺失,最好从子一代或子-代突变小鼠去除 SB 转座酶。


4. 突变小鼠的扩增通过小鼠培育扩增特定的 SB 诱导的转座子插入突变小鼠,然后用分子生物学方法进行基因型鉴定。

来源:丁香实验

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