原理
去垢剂裂解细胞法通常用于培养的动物细胞。典型的离子型去垢剂SDS(如2%SDS)能充分地裂解细胞。培养的动物细胞和细菌,如可以使用这种方式裂解。假如实验所用的抗体识别的抗原决定簇取决于自然空间构象,并对还原环境敏感,那么在裂解缓冲液中应除去二硫苏糖醇,并建议使用非还原/无脲的凝胶
材料与仪器
二硫苏糖醇(DTT) 1×Laemmli样品缓冲液
离心机 水浴锅
步骤
① 将1X107〜5X107个细胞加到1ml含有100mmol/L DDT的Laemmli样品缓冲液中。
②由于DNA的释放,在Laemmli缓冲液中细胞裂解液变得很黏,克服黏性问题有2种方法:
a.离心裂解液100000g,20min,除去DNA;
b.超声破碎裂解细胞,每次超声15〜30s,共4次,每次之间将样品在冰上放置15s。
③在95℃水浴加热样品5min。
④20000g离心5min.
⑤转移上清到一个新管中。
⑥样品(上清)现在可以用于电泳和免疫印迹。在免疫印迹研究中,制备培养细胞提取物时,蛋白样品必须满足以下条件:
a.溶于适合凝胶电泳系统的溶液中(如,溶液的pH值应该在7.0左右,并且盐浓度为200 mmol/L左右);
b.蛋白浓度不能超过特定凝胶系统的承载能力。对于传统凝胶,小胶的每个泳道的上样量不能>150μg的总蛋白
注意事项
1×Laemmli样品缓冲液:
2%SDS
10%甘油
60mmol/L Tris-Cl(pH3.8)
0.01%溴酚蓝
通常把Laemmli样品缓冲液制成2X或5X的储液比较方便。在使用前,加DTT至终浓度100mmol/L。
来源:丁香实验