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其他方案

相关实验:肽质量检索实验

最新修订时间:

材料与仪器

蛋白样品
质谱仪

步骤

用肽质量数据鉴定蛋白质所控制的实验参数中,最具决定性的参数是肽质量测量的精确度 。质量精确度越高,结果判定越可信。另一决定性参数是所用酶(或化学试剂)的专一性。酶越纯,专一性胞高,检索结果可信。常用的酶是胰蛋内酶。但是要注意的是,即便是高纯度的胰蛋白酶也会在非 Lys, 或 Arg 的氨基酸残基 C 端酶切(其后不是 Pro) 。所有蛋白酶都存在的问题是,如果蛋白序列中有 2个或更多个连续氨基酸残基是酶的切点,蛋白酶会对底物酶切小完全,留下漏切的位点和不完全的未端,许多检索程序把酶切的位点数目作为输入的一个检索参数。内切酶 LysC 是另一个具高度专一性的酶,此酶产生的自切产物比胰蛋白酶少,但同样也会有漏切位点,也会在非 Lys位点酶切(其后不是 Pro), 同样也要注意,不是所有的蛋白质,不论是否经凝胶分离,都适用于胰蛋白酶或其他专一性蛋白酶切,但是,凝胶分离的蛋白质。由于其处丁变性状态,通常酶切十分有效。




蛋白酶的性能很难改变,与之不同的是肽质量测定精确度依赖于所使用的仪器及其操作 最佳的肽质量检索应该用内标校正的单同位素质量。在 MALDI-MS 质谱仪中,通常,只有安装时间延迟聚焦/延迟提取(见前文)的仪器,能够站到肽质量的同位素分布分辨率。这种仪器达到 5ppm 的质量准确度,可确定单同位素质量,并在肽质量检索程中设立非常小的质量误控,这样高精度的数据减少了错误匹配的可能性。如来没有安装延迟提取选件,质谱仪应该用内标校正,且内标质量范围内包含被检测肽段的质量。没有延迟提取装过的仪器不能分辨同位素峰,仅得到平均分子质量。单同位素质量比平均分子质最更精确,因为单同位素质量是由单一同位素 C12 决定的,而平均质量是由 C12 和本同数目的间位素 C13 质量的平均值决定的(其他元素的同位素相似)。为了进一步增加肽质量的信度,开发正交法,对单个肽段的氨基酸序列或组成提供额外的,或限制性的信息。这种方法中,样品除用于原始质量测量外,还分出一部分用于正交分析。正交分析信息限制了用肽质性在数据库中检索鉴定蛋白质产生的多个肽段与同一质量匹配的情况。正交方法可分为以下几类 :


(I) 特异位点的化学修饰。 甲酯化,在每个羧基集团上增加 14个质量单位[如酸性氨基酸残基(Asp, Glu) 侧链或肽的 C 末端; 碘化反应,在酪氨酸上增加 126个质量单位; 及用 1:1 混合的乙酰氨/氚代乙酰氨在每个半胱氨残基上进行同位素标记。


(2) 测定肽段的部分氨基酸组成。有两种方法 如果肽段中的可交换氢在氘溶液中被交换,那么每一个氨基酸有其特定的交换数目,每个残基为 0 至 5个质量单位。因此,肽质量增加的总数就反映了肽的氨基酸组成,肽段部分氨基酸组成也可通过鉴别 MS/MS 质谱图中的氨离子 (immooium ion)峰来确定。


(3) 鉴定 N 末端氨基酸残基。 混合物中肽段的 N 末端氨基酸确定可用化学法,一步 Edman 反应或酶法,用氨肽酶除去末端氨基酸残基。


(4) 肽内不同酶切位点的鉴定 为了确定短肽中一个特定残基的存在及相对位点,有人采用酶切位点不同的酶对一级水解产物进行二次水解(次级水解)。同样也可把一份样品分为两等分用切点不同的酶平行水解


(5) 鉴定 C 末端残基 与 N 末端残基鉴定相似,用羧肽酶除去 C 未端氨基酸残基,某些情况下,会有一个或多个额外的残基被水解。但是当使用高度右~ 性的尚时,除去一个残基不能提供太多信息。

来源:丁香实验

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