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基本方案

相关实验:肽质量检索实验

最新修订时间:

原理


材料与仪器

蛋白样品
质谱仪

步骤

鉴定数据库中已有序列的蛋白质的算法基于以下一些理念:


(1) 肽段是由切点专一的试剂水解蛋白质产生的,通常用已知切点专一的蛋白酶。


(2) 这些肽段的质量由 MALDI-MS 或 ESI-MS 精确测定。


(3) 计符蛋白序列数据库中的每一序列被实验中所用水解试剂水解后产生的理论肽段的质量。


(4) 用试验得到的肽质量与数据库中的肽质量计算值相匹配,计算得分或排序值。


这种检索途径有一个明显的限制,就是被鉴定的蛋白质必须已经存在于序列数据库(翻译的核酸序列或蛋白序列数据库)。这一手段非常适用那些基因特性非常清楚的物种,特别是全基因组已知的物种(例如见 TIGR 数据库, http,//www. tigr. org/tdb), 亦用于那些已经建立详尽的蛋白质或 cDNA 序列数据库的物种。肽质量检索鉴定蛋白质方法的依据是实验中获得的蛋白质的多个肽段的质量数据与同蛋白质肽段质量计算值之间的相关性。因此,这一技术既不适用于检索表达序列怀鉴数据库 (EST) 翻译序列,也不适用于鉴定 2个以上的蛋白混合物。但是,对某些蛋内质可进行种属间鉴定,已经有了为这一特殊目的而编写的程序, EST 仅代表蛋白编码序列的一部分,其长度不足以产生供肽质量鉴定实验所需的足够的肽数目。如果水解蛋白质混合物,只产生其中部分特异肽质量的蛋白质的鉴定就不明显。 但如果每一个观察到的肽段都能与序列数据库中的某一蛋白精确相关,混合物中蛋白质的鉴定仍可行。


方法是从测得的肽质量中去掉与已被鉴定的蛋白质相关的所有朕段,用剩余的质量数检索数据库,将这一步骤重复循环进行。但是.,由于下面将要提到的一些原因,所有检测到的肽质量都与蛋白质的序列相符的情况很少发生,这不仅使混合物中各组分的鉴定变得复杂,还使单一的纯蛋白质的鉴定也复杂化,因此,了解那些未匹配的肽质量数的性质非常重要。下面将讲述与匹配正确与否有关的这些表观伪质量 (spurious masses) 存在的可能原因


(1) 蛋白质被正确鉴定,但是由于翻译后修饰或人为修饰及翻译后加工(如 N 或 C未端加工)产生了另外的质量 尽管某些质量的差异可能与这些修饰情况相符,但除非经实验证明,否则仅仅是假设。


(2) 蛋白质被正确鉴定,但存在非特异性的蛋白水解,或有杂蛋白酶存在。通过排除酶切位点专一的假设,确定候选蛋白是否会产生具有那些质量数的肽段.这样可以接受这种可能性。


(3) 蛋白质被正确鉴定,但有部分杂质蛋日质混在其中,如 2-DE 胶上的蛋白且可能由多个蛋白质组成。如果有足够多的未匹配肽质量数,就可以用这些数据单独进行肽质量检索,以证实存在另外的蛋白质。当然要做酶自切的对照实验,以鉴别所有的酶自切产物。


(4) 被鉴定的蛋白质或许是数据库中已登录蛋白的同源序列,或者是其序列的剪切变异体。某些检索程序允许实现跨种间检索,如果能得到另外确实的数据,这一方法还是很有用的。因为从基因特征不清楚的种属得到的蛋白质也许可以什基因特征清楚的种属的蛋白序列库中得到匹配鉴定。


(5) 蛋白质的鉴定结果是假阳性。如果没有其他数据,持别是实验数据的质量数精确度不高时,这一糟糕的结果很难被证实或证伪。如果所用检索程序是用鉴定结果的祖分值排序,而所得检索结果得分值又比较低时 该结果的证实就更加困难了,某个例子中,通过比较检索结果中排序第一和第二位(及后面)的得分值之萍,得到进一步确认为此蛋白压也可能在蛋白数据库中不存在。

来源:丁香实验

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