牛乳在自然发酵与酸败过程中细菌的生态演变实验

由于牛乳的特殊形态，刚采集的生牛乳含有少量不同的细菌，而牛乳的成分对细菌来讲是一种很好的营养基质，因此，在温暖的条件下，细菌即开始很快地繁殖。然而也不是所有的细菌都能如此，由于当时生牛乳的 pH 是中性，含有丰富的乳糖，故有利于其中自然存在的乳酸细菌例如乳链球菌（Streptococcus lactis）很快地繁殖。它们发酵乳糖产生乳酸，使牛乳的 pH 降低，并引起蛋白质凝结成乳酪状。这低的 PH 最终抑制了乳链球菌的繁殖，被比较能耐受低 pH 的发酵乳糖的菌种乳杆菌（Lactobacillus）所代替，它们完成乳糖发酵，并使 pH 更加降低。接着是酵母菌在这种低 pH 下利用乳酸而生长。随着乳糖和乳酸的消失，pH 再度上升，假单孢菌（Pseudomonas）和芽胞杆菌（Bacillus）能产生蛋白酶，开始分解凝结了的牛乳蛋白质，当蛋白质被利用完毕，牛奶的分解也就完成了。

生牛乳的这种生态学演变的自然过程是一个典型的例子。原始细菌的活动为以后的细菌创造了有利的生化条件，因而能观察到一个微生物群体接替另一微生物群体的一系列演变。这种自然演变的基本原则也能在地面环境中的高等植物和动物中实现。自然界其他微生物也会发生同样的演变过程。

巴斯德消毒法的目的是杀灭牛乳中的病原菌，但不能杀灭芽胞杆菌，用此法消毒过的牛乳，破坏了其中的正常菌群（除芽胞杆菌以外），因而不能产生带酸味的酸牛乳——典型的乳酪牛乳，但能越过演变的早期而趋向于更不适用的最后时期。故牛乳酸败的自然过程与食品工业有密切的关系。现代工业生产的酸牛乳是先将牛乳进行消毒，而后接种乳链球菌与乳杆菌的纯种发酵制成。目前市场上销售的鲜牛乳，除采用巴氏消毒法消毒外，还有高温消毒和超 高温瞬时消毒，制备更高品质的牛乳。

本实验是将生牛乳原始样品与以后培养在 30℃ 下约每两天取一次的样品分别测其 pH 和涂片，进行革兰氏染色，油镜下观察主要细胞的形态、排列、革兰氏阳性或阴性以及单个视野中的平均细菌数。由于每次涂片均取一个接种环，涂抹玻片约 2.5 cm² 的面积，因此，所测菌数的结果将是半定量的。

生牛乳样品
革兰氏染液 二甲苯
中性到酸性的 pH 试纸 玻片 显微镜

1. 旋转装牛乳的三角烧瓶，使样品充分混匀。

2. 用灭菌滴管或接种环以无菌操作取一滴牛乳，放在 pH 试纸上比色，将结果记录于「结果」的表格内。

3. 用无菌操作取满一接种环牛乳，在玻片上均匀涂抹 2.5 cm² 面积（可先在纸上画 2.5 cm² 的方格，然后将玻片放在纸上），玻片标明日期。

4. 玻片放空气中干燥。贮存在一有盖盒内，待整个实验的所有涂片制成后一起进行「7」以后的步骤或每片先进行第「7」步骤，再贮存，待所有玻片制成后再进行「8」以后的步骤。

5. 牛乳样品放 30℃ 温箱内培养。整个实验（约需 10 d）均需在此温度下培养。

6. 每两天重复取样测 pH 和制作涂片。每次制作涂片用同一接种环，取同样的量。直至牛乳完成变酸过程和开始腐败为止。

7. 所有涂片都用二甲苯处理约 1 min，以除去牛乳的脂肪，干燥后，火焰固定。

8. 革兰氏染色。

9. 油镜下观察，数几个视野的主要类型的细菌数，计算每一视野的平均数，描写细菌类型，注明形态（杆状或球状）、大小（长或短，细长或宽大）以及排列（单个或呈链状）等。

整个生态演变过程可分为四个时期，下面介绍每一时期的 pH 与主要细菌及细菌的特点，作为记录与解释所得结果的指导。但不能指望每组结果与这一指导完全一致，因为此实验结果常因原始样品中细菌的数量和种类、培养温度和其他环境因素的不同而不同的。

第一时期（pH6.0～7.0）乳链球菌：革兰氏阳性，呈链状排列。在中性 pH 下繁殖与发酵乳糖而产生乳酸。

第二时期（pH 3.5～4.0）乳杆菌属：细长的革兰氏阳性杆菌，常呈链状，在比较低的 pH 下繁殖，完成乳糖的发酵。

第三时期（pH 4.0～5. 0）酵母菌：大革兰氏阳性、卵圆形细胞，在低 pH 下繁殖，利用乳酸，因而 pH 再次增高。

第四时期（pH 5. 0～6.5）腐败微生物：有假单胞菌属和芽孢杆菌属。假单胞菌属为小革兰氏阴性杆菌，单个存在；芽孢杆菌属为大革兰氏阳性杆菌，常呈链状，当营养耗尽时还可能产生芽孢。它们在较高的更碱性的 pH 下繁殖，消化蛋白质凝乳和利用氨基酸作为营养物质。