DOTAP 法

将感兴趣的外源基因亚克隆到质粒转移载体上，外源基因的两端为痘苗病毒基因组非必需基因片段。随后，将重组质粒转染病毒感染的细胞，痘苗病毒基因组与质粒上同源的部分发生同源重组。应用适当的筛选方案，经几轮噬斑纯化，从细胞裂解物中获得重组病毒。

1. 将目的基因亚克隆到 pSC11、pRB21、pSC65、pLW9 或其他合适载体的多克隆位点（MCS）上，分离质粒。

2. 将 1 × 10⁶ 的 CV-1、BS-C-1，BHK-21 或 CEF 细胞用完全 MEM-10 培养基接种到 25 cm² 组织培养瓶中，培养至接近单层生长至汇片的程度（通常过夜）。

3. 使用前，将等体积的痘苗病毒储液与 0.25 mg/ml 胰酶混合，涡旋混匀。在 37℃ 水浴锅中保温 30 min，并在保温过程中每隔 5～10 min 涡旋混匀一次。对于 MVA， 以在冰上超声 30 s 打散病毒团块代替胰酶解。病毒储液的滴度常常在 2 × 10⁹ pfu/ml 左右，但根据其来源的不同病毒滴度也可能低一些。

4. 用完全 MEM-2.5 培养基将病毒稀释到 1.5 ×10⁷ pfu/ml。在汇片生长的单层细胞培养瓶中吸出培养基，加入 1 ml 稀释的病毒（0.05 pfu/细胞）转染。培养 2 h，每隔 15 min 轻轻摇动一次。在转染结束前 30 min，按照下面介绍的方法制备 DNA。

5. 在 12 mm × 75 mm 聚苯乙稀管中加入 70 μl pH 7.4 20 mmol/L HEPES 和 30 μl DOTAP。在第二管中，加入 5 μl 含有目的基因的重组质粒（来自步骤 1）到 20 mmol/L HEPES 至终体积为 100 μl。 （有关痘苗病毒 DNA 的加入参见 CaCl2 法步骤 5。）

6. 将 DNA 溶液加入到 DOTAP 溶液中，室温放置 15 min，再加入 1 ml OptiMEM 培养基。

7. 从单层细胞吸去病毒接种物（步骤 4）。

8. 将 DNA/DOTAP 溶液（步骤 6）加入细胞，37℃ 放置 4 h。

9. 吸出培养基，加入 5 ml 完全 MEM-10 培养基，37℃ 培养 2 天。

10. 用刮刀或无菌的橡皮细胞刮刀，轻轻刮下细胞，转移到 15 ml 锥形离心管中，5～10℃，1800 g 离心 5 min，弃培养基。

11. 将细胞用 0.5 ml 完全 MEM-2.5 培养基重悬。反复冻融裂解细胞悬液：用干冰/乙醇冷冻使细胞冻结，37℃ 水浴及涡旋将细胞解冻。如此进行 3 次。

12. 将细胞裂解物置 -70℃ 保存，直至筛选步骤进行（见「重组病毒噬斑筛选实验」）。

1. 所有步骤必须在生物安全柜中进行无菌操作。

2. 培养都在加湿的 5% CO₂ 培养箱中 37℃ 培养，除非有特殊说明。

3. 与活细胞接触的器械和试剂都应该是无菌的。

4. 在转染中不需要包含痘苗病毒 DNA，但加入可以导致高效率的重组。如果要加入，1 μg 痘苗病毒 DNA 混合 5～10 μg 重组质粒 DNA，在加入 DOTAP 前，涡旋混匀以切割大分子质量的 DNA。