光电比浊计数法

当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池精确测出（图 VIII-4）。因此，可用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度。作出光密度--菌数标准曲线。然后，以样品液所测得的光密度，从标准曲线中查出对应的菌数。制作标准曲线时菌体计数可采用血细胞计数板计数，平板菌落计数（见显微镜直接计数法实验和平板菌落计数法实验）或细胞干重测定等方法。

本实验采用血细胞板计数。

光电比浊计数法的优点是简便、迅速，可以连续测定，适合于自动控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌体浓度影响之外，还受细胞大小、形态、培养液成分以及所采用的光波长等因素的影响。因此，对于不同微生物的菌悬液进行光电比浊计数应采用相同的菌株和培养条件制作标准曲线。光波的选择通常在 400～700 nm 之间，具体到某种微生物采用多少还需要经过最大吸收波长以及稳定性试验来确定。另外，对于颜色太深的样品或在样品中还含有其他干扰物质的悬液不适合用此法进行测定。

1. 标准曲线制作

1.1 编号取无菌试管 7 支，分别用记号笔将试管编号为 1、2、3、4、5、6、7。

1.2 调整菌液浓度用血球计数板计数酿酒酵母培养液，并用无菌生理盐水分别稀释调整为每毫升 1×10⁶、2×10⁶、4×10⁶、6×10⁶、8×10⁶、10×10⁶、12×10⁶ 的细胞悬液。再分别装入已编好的 1 至 7 号无菌试管中。

1.3 测 OD 值将 1 至 7 号不同浓度的菌悬液，摇匀后于 560 nm 波长，1 cm 比色杯中比色测定 OD 值。比色时，用无菌生理盐水作空白对照，并将 OD 值填入下表。

1.4 以光密度（OD）为纵坐标，每毫升细胞数为横坐标，绘制标准曲线。

2. 样品测定

将待测的样品用无菌生理盐水适当稀释，摇匀后，用 1 cm 比色杯，560 nm 波长测定光密度。测定时用无菌生理盐水作空白对照。

3. 根据所测光密度值，从标准曲线查得每毫升的含菌数。

1. 每管菌悬液在测定 OD 值时均必须先摇匀后再倒入比色皿中测定。

2. 各种操作条件必须与制作标准曲线时的相同，否则，测得值所换算的含菌数就不准确。