光电比浊计数法
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实验三十二 光电比浊计数法
一、目的要求
1.了解光电比浊计数法的原理。
2.学习光电比浊计数的操作方法。
二、基本原理
细菌菌体是不透光的,光束通过细菌悬液,将会由于被散射或被吸收而降低其透过量。细菌悬液的浓度同光密度成正比,同透光度成反比,而光密度或透光度可以借光电池精确测出。所以可用光电比浊计来测定细菌相对数目。可先用血球计数板计数,再将菌悬液分别稀释调整为每毫升含不同的菌数,通过分光光度计分别测定其光密度(尽量控制光密度值在0.1—0.65之间,以得到较高精确度)。然后以光密度(OD)作纵坐标,以每毫升不同菌数为横坐标绘制标准曲线。再将待测菌悬液适当稀释,同法进行比浊测定,根据所测光密度值就可以从标准曲线上查得每毫升的细菌数。此法简便、迅速,可以节省许多稀释平板计数法的时间,便于在生产实践中控制细胞的数目。但颜色太深的样品或在样品中还含有其他物质的悬液,不能用此法测定。
三、器材
酿酒酵母培养液,72型或721型分光光度计,血球计数板,显微镜,试管,吸管,吸水纸,无菌生理盐水等。
四、操作步骤
1.标准曲线制作
(1)编号取无菌试管7支,分别用记号笔将试管编号为1、2、3、4、5、6、7。
(2)调整菌液浓度用血球计数板计数酿酒酵母培养液,并用无菌生理盐水分别稀释调整为每毫升1×106 、2×106 、4×106 、6×106 、8×106 、10×106 、12×106 的细胞悬液。再分别装入已编好的1至7号无菌试管中。
(3)测OD值将1至7号不同浓度的菌悬液,摇匀后于560nm波长,1cm比色杯中比色测定OD值。比色时,用无菌生理盐水作空白对照,并将OD值填入下表。
(4)以光密度(OD)为纵坐标,每毫升细胞数为横坐标,绘制标准曲线。
2.样品测定
将待测的样品用无菌生理盐水适当稀释,摇匀后,用1cm比色杯,560nm波长测定光密度。测定时用无菌生理盐水作空白对照。
3.根据所测光密度值,从标准曲线查得每毫升的菌数。
五、实验报告
1.结果
每毫升样品菌数=查得数×稀释倍数。
2.思考题
(1)微生物光电比浊计数的原理是什么?这种计数法有何优缺点?
(2)微生物光电比浊计数法在生产实践中有何应用价值?