噬菌体效价的测定实验
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原理
噬菌体的效价就是 1 ml 培养液中所含活噬菌体的数量。效价测定的方法,一般应用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上,噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑,因此,能进行噬菌体的计数,但因噬菌斑计数方法其实际效率难以接近 100%(—般偏低,因为有少数活噬菌体可能未引起感染),所以为了准确地表达病毒悬液的浓度(效价或滴度)一般不用病毒粒子的绝对数置而是用噬菌斑形成单位(plague-forming units, 简写成 pfu)表示。
材料与仪器
大肠杆菌
肉膏蛋白胨琼脂平板 液体培养基的小试管 含琼脂培养基的试管
灭菌小试管 灭菌吸管 48℃ 水浴箱
步骤
1. 稀释噬菌体
1.1 将 4 管含 0.9 ml 液体培养基的试管分别标写 10-3,10-4,10-5,和 10-6。
1.2 用 1 ml 无菌吸管吸 0.1 ml 10-2 大肠杆菌噬菌体,注入 10-3 的试管中,旋摇试管,混匀。
1.3 用另一支无菌吸管从 10-3 管中吸 0.1 ml 加入 10-4 管中,混匀,余类推,稀释至 10-6 管。
2. 噬菌体与菌液混合
2.1 将 5 支灭菌空试管分别标写 10-4,10-5,10-6,10-7 和对照。
2.2 用吸管从 10-3 噬菌体稀释管吸 0.1 ml 加入 10-4 的空试管内,用另一支吸管从 10-4 稀释管内吸 0.1 ml 加入 10-5 空试管内,直至 10-7 管。
2.3 将大肠杆菌培养液摇匀,用吸管取菌液 0.9 ml 加入对照试管内,再吸 0.9 ml 加入 10-7 试管,如此从最后一管加起,直至 10-4 管,各管均加 0.9 ml 大肠杆菌培养液。
2.4 将以上试管旋摇混匀。
3. 混合液加入上层培养基内
3.1 将 5 管上层培养基溶化,标写 10-4,10-5,10-6,10-7 和对照。使冷却至 48℃,并放入 48℃ 水浴箱内。
3.2 分别将 4 管混合液和对照管对号加入上层培养基试管内。每一管加入混合液后,立即旋摇混匀。
4. 接种了的上层培养基倒入底层平板上
4.1 将旋摇均匀的上层培养基迅速对号倒入底层平板上,放在台面上摇匀,使上层培养基铺满平板。
4.2 凝固后,置 37℃ 培养。
5. 观察平板中的噬菌斑,将每一稀释度的噬菌斑形成单位记录于实验报告表格内,并选取 30~300 个 pfu 数的平板计算每毫升未稀释的原液的噬菌体数(效价)。
噬菌体效价=pfu 数×稀释倍数×10
注意事项
常见问题
来源:丁香实验