二奎琳甲酸检测法

在碱性环境下蛋白质分子中的肽键结构能与 Cu^2＋络合生成络合物，同时将 Cu^2＋还原成 Cu^＋。而 BCA 试剂可敏感特异地与结合，形成稳定的有颜色的复合物。 在 562nm 处有高的光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含童。

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待测蛋白质样品
BCA NaOH 碳酸钠 碳酸氢钠 五水硫酸铜 酒石酸钠
分光光度计 37℃ 水浴锅 小烧杯 移液管 枪头和加样枪 试管 试管架

1. 溶液

1.1 试剂 A，1L

10 g BCA （1％）

20 g Na₂CO₃·H₂O） （2％）

1.6 g Na₂C₄H₄O₆（·2 H₂O） （0.16％）

4 g NaOH （0.4％）

9.5 g NaHCO₃ （0.95）

加水至 1L，用 NaOH 或固体 NaHCO₃ 调节 pH 值至 11.25。

1.2 试剂 B，50 ml

2 g CuSO₄·5 H₂O（4％）

加双蒸水至 50 ml

试剂 A 和试剂 B 在室温下至少稳定 12 个月，并可购买商品化试剂。

1.3 标准工作试剂（SWR）

50 份试剂 A

1 份试剂 B

可稳定一周。

2. 检测

2.1 将 1 倍体积样品与 20 倍体积的 SWR 混合（例如：100 ul 样品加入 2 ml SWR）；

2.2 在室温孵育 2 h（a）或 37℃ 30 min（b）；

2.3 在（b）情况下冷至室温；

2.4 在 562 nm 读取光密度（OD） 值。

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1. 为促进 BCA 法的反应进程，可将实验试管置于微波炉中孵台 20s 以内。

2. 在样品冷却至室温后。 每 10 min 光吸收值升高 2.3％。

3. BCA 法检测微量蛋白灵敏度　0.5～10 ug/ml，应采用浓缩试剂，并需要在 60℃ 反应 60 min。

4. 与 Lowry 法相比，采用 BCA 法时，如果样品中含有脂类物质将明显提高光吸收值。

5. 在含巯基试剂和去垢剂的缓冲液中 BCA 呈色发生变化。

6. 蛋白质样品经 DOC-TCA 沉淀后，会去除多数干扰物质。

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