采用 HO 产生二倍体

酵母菌株NE2 AAY1017 AAY1018 质粒PCY204
YPD 平板 培养管 SC-ura平板 5-FOA平板

第1天

把菌株9-1在YPD平板上划单克隆，于30°C下培养


第3天

上午，把菌株9-1的菌落接种到5mlYPD培养液中，于30°C下培养。将YPD平板置于4°C下储存以备第13天使用。

第4天

按照“技术和方案1，酵母的高效转化”将未切的质粒PCY204(来自指导老师）转化到菌株9-1。记住设置一个不含DNA的转化对照。每个转化液取20ul涂于SCura平板，在30°C下培养。不含DNA的转化对照同样操作。

第7天

把4个转化子在SC-ura平板上划单克隆，于30°C下培养。

第9天

将每个转化子的单菌落接种到5mlYPD，于30°C下培养。这将使丢失质粒的细胞得以生长.

第10天

使用血球计数板（附录G，用标准血球计数板进行酵母细胞计数）测定细胞密度，用无菌蒸馏水适当稀释。用每1〇〇4体积含有105?106个细胞的菌液涂5-FOA平板。

对URA3基因进行反筛选以便使已经丢失了pCY204的细胞能够生长，将剩下的YPD培养物保存于4°C以供第12天使用。

第12天

将每个转化子的9个5+0八1^菌落接到YPD平板（共36个）制备一块原平板，包括亲本菌株9-1。从第10天培养的4个中间培养物中分别取34点到原平板上，在30°C下培养此YPD平板。将菌株9-2和9-3分别接到2管5mlYPD培养液中，在30°C下振荡培养。

第13天

用15u1菌株9-2和15u1无菌水涂SD平板，使其干燥。用菌株9-3在另一块SD平板上重复这一过程。将原平板影印到SD平板上。每一个平板都用新的绒垫以防止平板间的污染。同时将原平板影印到一个产孢平板和一个SC-ura平板上。

第15天

统计接合能力和在SC-um平板上的生长情况。

第17天

统计孢子形成能力，用牙签将细胞挑到载玻片上的水滴中，在相差显微镜下观察细胞