用两步基因置换法进行交配型转换

酵母菌株YSC006 YSC005 质粒pSC9 pSC11
YPD 平板 SC-ura平板 产孢平板 无菌绒垫 SD 平板

第 1 天

把菌株 9-4 和 9-5 在 YPD 平板上划单克隆，于 30°C 下培养。1、2、3、4 组使用菌株 9-4;5、6、7、8 组使用菌株 9-5。

第 3 天

上午，把菌株 9-4 和 9-5 的单菌落接种到 5 mlYPD 培养液中，于 30°C 下培养。将 YPD 平板置于 4°C 下储存以备第 13 天使用。

第 4 天

按照「技术和方案 1，酵母的高效转化」转化菌株 9-4 和 9-5。从指导老师那里获得酶解质粒 DNA，用 pSCll 转化菌株 9-4, 用 pSC9 转化菌株 9-5。记住设置一个不含 DNA 的转化对照。每个转化液取 200W 涂于 SC-um 平板，在 30°C 下培养。不含 DNA 的转化对照同样操作。

第 6 天

把 4 个转化子在 SC-ura 平板上划单克隆，于 30°C 下培养。

第 9 天

将每个转化子的单菌落接种到 5 mlYPD，于 30°C 下培养。

第 10 天

使用血球计数板（附录 G，用标准血球计数板进行酵母细胞计数）测定细胞密度，目无菌蒸馏水适当稀释。用每 100ul 体积含有 105~106 个细胞的菌液涂 5-FOA 平板。此平板将用于反筛选插入到 MAT 基因座重复区的 URA3 基因。通过同源重组，URA3 基因的「突环」形成过程产生了 5-FOAR。剩下的 YPD 培养物于 4°C 保存待第 13 天! 用。

第 13 天

将每个转化子的 9 个 5-FOAR 菌落接到 YPD 平板（共 36 个）制备一块原平板，包亲本菌株 9-4 和 9-5。（从第 3 天保存于 4°C 下的平板得到一个亲本菌株，另一亲本菌可从邻组得到。）从第 9 天培养的 4 个中间培养物中分别取 1(^1 点到原平板上，在 30°C 下培养此 YPD 平板。

第 14 天

用 100ul 菌株 9-2 涂于 SD 平板上（来自实验九 A，第 13 天），使其干燥。用菌株 9-3 在另一块 SD 平板上重复这一过程。将原平板影印到 SD 平板上。每一个平板都用新的绒垫以防平板间的污染。同时将原平板影印到一个产孢平板和一个 SC-mra 平板上。

第 16 天

统计交配能力和在 SC-ura 平板上的生长情况。
第 17 天

统计孢子形成能力。