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    基本方案7 体内基因传递到肺部

    最新修订时间：

    材料与仪器

    cotton rat
    异氟烷 纯化的重组腺病毒 PBS 粉末状干冰 异戊烷填充材料
    纱布垫子 锥形离心管 异丙基乙醇海绵 解剖刀 注射器 塑料包埋块 恒冷切片机

    步骤

    1•用异氟焼麻醉一只80〜120g 的 cotton rat, 具体做法是用一块异氟烧浸透纱布垫子 置于一只50m l 圆锥形管底部，在把管口放奄鼠的鼻子上。通过观察呼吸次数来判断 麻醉深度，并且通过调整圆锥形管离鼠鼻子的距离来控制麻醉深度。 2. 用异丙基乙醇海绵清洁鼠的颈部，并且用锋利解剖刀切一条I c m 长的正中线切口。 通过钝式解剖暴露气管，并且通过气管周围的肌肉切一个3m m 的切口。用—支^ 30G 针头的Iml注射器慢慢地将总体积为100〜150jul含 IXlO1t5 〜5X 101 。感染颗粒 的 P B S 直接通过气管壁而不要开切口灌输进去，然后补灌30〇4空气。 3. 用两个U 形钉缝合切口，然后将动物关进笼内。
    对 小 鼠 而 言 ， 需 要 根 据 动 物 的 总 千 克 重 来 减 少 病 毒 的 总 剂 量 和 体 积 。 一 般 而 言 ， 一 只 25g 重 的 小 鼠 耐 受 2X 109pfu的 重 组 病 毒 ，通 过 25〜 3 5 4 的 总 体 积 注 入 。 在 这 步 操 作 中 讲 到 的 体 积 将 会 把 病 毒 传 递 到 气 道 和 肺 泡 区 域 。 为 了 提 高 气 管 的 基 因 转 移 而 限 制 肺 泡 区 域 的 基 因 传 递 ， 可 以 使 用 包 含 相 同 剂 量 病 毒 的 更 小 接 种 物 体 积 （ rat50jul， micel5jLtl )。 4 . 通过向腹膜内给药，用过度剂量（2〇〇 m g /k g ) 的戊巴比妥使动物安乐死。 5 . 打开胸腔暴露近身体中央端的气管。将 18G A n g i o C a t h 插到装有37 °C O C T 培养基 和 P B S 混 合 物 （I : 1 ) 的 3m l 注射器上。将 A n g i o C a t h 输液管末端插人气管近身体 中央端，用三重有节缝线结扎。 6. 轻轻用力推注射器内芯直到肺部在胸腔内膨胀到可见程度（ 一 般 2m l 〇ciyp B S )。 不要使其过度膨胀。移去心脏-肺小盒放到冰预冷的P B S 中 l O m i n 。 7•从冰预冷的P B S 中拿出心脏-肺小盒，放在冰预冷的板面上，剪掉非肺组织。 8. 将肺切成大楔形物（ 约 l c m )，放在盛满1〇〇%〇 C T 包埋培养基的塑料包埋块，使切 面贴紧包埋块底部。 9. 用粉末状干冰/异戊烷填充材料冷冻包埋块。在冷冻状态处理组织样本以使其仍然贴 紧包埋块底部。 10. 用恒冷切片机切出6^m 的冰冻切片，并且进行多重组织学分析，如免疫细胞化学、 组织化学和原位杂交等。 支 持 方 案 1 收 获 人 类 支 气 管 的 异 种 移 植 物 做 形 态 学 分 析 以 评 价 转 基 因 表 达 . 材 料 （ 标V 的条 目 参 见 附 录 1) 鼠隐藏异种移植物（ 基本方案5 和 6) V P B S 最佳切割温度（ O C T ) 培 养 基 （ Ba x t e r) 粉末状干冰/异戊烧填充材料 解剖工具：小尖剪刀、镊子和剃刀片 塑料包埋块（ Ba x t e r) 恒冷切片机 1.通过 C O 2 窒息对小鼠施无痛致死术取隐藏异种移植物，小心切下异种移植物小盒， 放在一■块衬有石错膜的平坦表面。用两块刹刀片小心地将异种移植气管切成2m m 圆 环通过相对的史托刀片切割边缘。去掉异种移植组织输液管接触的末端。 2•在P B S 里漂洗切出的圆环并在不含棉绒纸吸干以去掉内腔多佘的黏液。不要用镊子 夹紧上皮表面。 这 些 组 织 现 在 可 以 直 接 用 来 做 组 化 染 色 或 如 下 面 描 述 的 步 骤 一 样 新 鲜 冷 冻 在 O C T 包 埋 培 养 基 。 3.缓慢降低异体嫁接环，将切面向下，装入到一个装满 O C T 的塑料嵌入块中。确定 O C T 能够进入异体嫁接环的腔内，否则冷冻的部分很难切
    4. 用钝的钳状骨针将环推到块的底部。当放置样本时不要进人异体嫁接环的腔内。最 多 6 个环可以植入到一个块中。 5. 将组织块放入粉末状的干冰中或异戊环的黏合剂中，储存在一80°C直到切片。 6•在恒冷切片机上将组织块切成6jum的冷冻切片。在免疫组化前避免新鲜的切片重复 的冻融。一旦切片置于玻片上，应该将其置于恒冷切片机内（ 一18°C)，直到染色， 避免风干。或者切片也可以在一80°C下冻存几个星期时间，不会大量丧失P-半乳糖 苷酶的活性。

    来源：丁香实验

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