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    基本方案5 人类支气管异种嫁接的繁殖

    最新修订时间：

    材料与仪器

    Fisher 344 大鼠 无胸腺小鼠
    乙醇 MEM 初级支气管上皮 氯胺酮 甲苯噻嗪 PBS 聚乙烯酮碘 HamF-12 培养基
    硅橡胶管 聚四氣乙燦树脂管 转换器 铬镍合金A钢线 组织培养皿 气体灭菌囊 螺帽管 2-0编织缝线 止血钳

    步骤

    1. 切割异种移植盒的输液管和接头到一定长度并按照图13.5. 3A 装配。放置移植盒在 IOOmm组织培养皿中。用高压灭菌锅密封并蒸汽灭菌。 2 . 通过C O 2 窒息安乐死雄性Fisher 3 4 4 鼠，并将其固定在泡沫聚苯乙烯床上。 3. 在层流罩（ 或在一个干净的开放操作台上）内工作，用过量的7 0 % 乙醇清洗小鼠的
    颈和胸并且切除从咽到龙骨状突起（ 咽末端的支气管分叉）的气管。不要切到动脉。 立即放每个被切下的气管在隔离的2m l 带螺帽的试管中并置于冰上直到所有的气管 被收获。 4•剥光通过3 个冷冻巡回在一8( T C 的气管上所有能存活的上皮组织并在室温解冻。清 洗过多脂肪的气管并切割到合适大小（ 典型的是在第一和第十三气管环） 。用 1〇1111 的冷的M E M 冲洗每个气管内腔。按照长度配对气管并混合每对到同样的试管中。 置一80°C 保存。 以 下 所 有 的 程 序 要 在 无 菌 的 层 流 罩 中 进 行 。 5. 用 2-0被编织的缝线结扎小鼠气管到被系在试管b 上的接头如图I3.5. 3b 所示。用 三个接系牢缝线并将其绕在试管和气管共三次。 6. 在无菌的条件下，用 20^1微量移液器将含有I X I O 6〜2 X I O 6 原发的支气管气道上皮 细 胞 的 冷 的 培 养 基 C 注射到鼠气管开放端。当细胞注射到气管时，尽可能深的 将移液器tip头伸到气管并慢慢的撤出。 7 . 当心别让细胞遗漏，结扎鼠气管的开放末端到被系在试管c 的结头上如图13. 5. 3B 所示。通过伸展它到生理长度获得鼠气管长度并用一把止血钳夹紧管b 和管 a 。 剩余 的两个缝线要如图13. 5. 3B 要固定接头到管d 。 8•用含1〜2m l 培养基C 的 100m m 组织培养皿放接种细胞异种移植盒。在 37°C 、 5 % C 〇2 潮湿的培养箱中，孵 育 1〜2h 来 平 衡 p H 值。为了移植，要用到一个小的密封 无菌的容器。它应该预先用异种移植培养皿孵育来维持C 〇2浓度。 9.通过用P B S 腹膜内注射l〇〇 m g /k g 氯胺酮和20m g /k g 甲 苯 噻 嗪 来 麻 醉 雄 性 无 胸腺小鼠。放小鼠在一个用无菌布单覆盖的温暖的水瓶中并从高压灭菌锅中取出无 菌的外科手术器械。 10. 用聚乙烯酮碘和乙醇清洗外科手术切口位点。切开4 个切口如图13.5. 4B 所示。在 小鼠的颈部切开一个非常小的切口（0.16c m ) 仅用来通过管子。在小鼠的胁腹切开 两 个 I c m 长的切口。通过剥离分离肌肉和皮肤并置异种移植盒到皮下，用钳状骨针 直到异种移植管隧穿到颈部后的切口（ 图 13. 5. 4C )。 11. 用 2〜3 个 U 形钉封闭每个最大的切口。用一个额外的u 形钉来锚定每个异种移植 管到管c 的弯曲部分的皮肤处。当 插 人 U 形 钉 时 ，当心不要 刺 伤 移 植 管 （ 图 13.9.4C ， 立 体箭头） 。 12. 转移鼠到无菌的笼子里。确保小鼠温暖并实施监测直到它苏醒。保持小鼠隔离，因 为它们可能相互咀嚼管子，并保持无病原体伺养。在更换笼子前，高压灭菌所有的 笼子、食物和水。 13.移植后前3 周 ，用 0 •75in， 21G 蝶翼静脉输液针和I m l H a m F -12培养基每周清洗 一次异种移植处，为了移除过多的分泌黏液，用下面的技术操作。如果有必要，用 2 5 % 〜5 0 % 剂量的氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉小鼠。 a. 系一个21G 针到一个移去活塞的I m l 注射器上并注满室温的H a m F -12培养基。 将针从异种移植物的一个末端插入管子。 b . 将一个系有活塞的注射器蝶翼21G 输液针插人到异种移植物的相对的一端。 c. 通过拔第一 个注射器的活基形成负压来吸出移植物内腔中的液体。最后，吸出进

    来源：丁香实验

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