基本方案4 植入胶原的基因修正的成纤维细胞入成年鼠脑的腔内

1.用 PBS 和胰酶清洗基因修正的成纤维细胞。用 37℃ DMEM/10%FBS 培养基重悬细胞。细胞计数并调整细胞浓度约为 162ul 含 1.2X105 细胞。平分 162ul 至 1.5 ml 的圆锥管中。

2.每个等分量，加 6.94 的 O.1 mol/L NaOH 并温和吹打混合细胞。如果颜色没有变成粉色，则加更多的 0.1mol/L NaOH。

3.立刻加 81ul 的 0.3% 的胶原酶并吹打混匀。拧紧管子上下颠倒使胶原酶混匀。拧松管子并放于 37°C，10% CO2 孵育箱过夜。如果转基因产物从细胞中分泌出来，用上层清液定量数量。

4.麻醉并准备手术用的成年宿主鼠（基本方案 1，第 2~5 步）。

5.确定前囟点。从鼠脑图谱中确定坐标，用牙科钻头从要求的点到头盖骨上开一个 1.5 mm 宽的洞。用 27 G 针切开硬脑脊膜。

6.用有真空装置的修改的巴斯德管通过温和地吸出组织在要求的脑部区域上制造一个 aspirative 损害腔。

这个管子是通过弯曲管头修改的并且在管子的顶部有洞。当它与真空装置相连时，液体可以通过用手指打开或按住小洞来控制流量。这样的设计可以更好地控制组织的损害。

7.用平端的钳状骨针，移开 2~3 mm3 的含有成纤维细胞胶原填料。将其移入伤口内，并且用 TK 凝胶泡沫推下填料。填料应该填满腔。如果需要，填料可以被修剪成腔的大小，但是细胞移植的数量是不知道的。

8.将小鼠从脑功能区定位支架下移开，清洗头盖骨，在伤口上面盖灭菌纸巾。将皮肤盖拢，用伤口夹夹好皮肤切口，将小鼠转移至恢复笼。