材料与仪器
步骤
用 BVboost 系统制备重组杆状病毒
材料
试剂
B a c t o 琼 脂
Bluo-gal/X-gal (可选择）
B o o s t 溶 液 1
10m m o l / L Tris-HCl (p H 8. 0)
10m m o l / L E D T A
l 〇〇/xg/6m l R N a s e A
过 滤 除 菌 ， 4°C 储 存 。
B o o s t 溶 液 2
0•2m o l / L N a O H
1 % (m /V ) S D S
过滤除菌，室温储存。
B oost 溶 液 3 (3 m o l/L K C H 3C O O , p H 5. 5)
高温高压灭菌，室温储存。
细胞系
大 肠 杆 菌 D H 10 B a c A T n 7 , 用 于 电 转 的 感 受 态 细 胞 。
昆 虫 细 胞 S / 9 (A T C C C R L -1 7 1 1 )
C ellfectin (Invitrogen)
供 体 质 粒（p B V b o o st 或 其 任 意 衍 生 物 ；图 2)
乙 醇（7 0 % )
庆 大 霉 素
无 菌 水
昆 虫 细 胞 生 长 培 养 液 ，无 血 清（例 如 ， I n s e c t X p r e s s [ B io w h it t a k e r ] 或 Sf-900 IIS F M [In vitrogen] ) 。
异 丙 醇
IP T G ( 可 选 择 ）
L B 培 养 液
IOg bacto-胰 蛋 白 胨
5 g bacto-酵 母 提 取 物
IOg N aC l
加水至 1L ，用 lmol/L N a O H 调 p H 至 7. 5。
S. 0 . C . 培 养 基
2 g b a c to 胰 蛋 白 胨
0• 5 g b a c to 酵 母 提 取 物
Im l lm o l/ L N aC l
0.25m l lm o l/ L K C l
Im l 2 m o l/L M g 储 存 液（lm o l/ L M gSO 4 , lm o l/ L M gC l2)
加 水 至 1L
蔗 糖
T E 缓 冲 液（pH 8 .0 )
四 环 素
lO m m ol/L T ris-H C l
lm m o l/L E D T A
仪器
用 于 大 肠 杆 菌 和 昆 虫 细 胞 培 养 的 培 养 箱
离 心 机
电 转 仪 和 电 转 杯
用 于 细 胞 培 养 塑 料 器 皿 和 移 液 器
无 菌 试 管
方法
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大肠杆菌中杆状病毒基因组的转座
1 . 准备 LB 琼 脂 平 板
a. 将 7. 5 g 的 baco-琼脂加入到 l 〇〇 m l 5X L B 培养液中溶解，加水至 500ml。
b•高温高压灭菌。
c. 在水浴中将温度平衡至 53°C 。
d. 加 1 0 % 的蔗糖、 l O ug/m l 四环素和 7 ug/ml 庆大霉素。
如果要通过颜色来筛选转座，加 lOOug/ml Bluc-gal 或 60ug/ml X-gal 和 l 〇〇 mmol/L IPTG(步骤 9 和 11)。
e. 倒平板。
100 ml LB-琼脂足以倒 15 个平板。
2•将可用于电转的 D H 10BacATn7 大肠杆菌置于冰上，将冰浴的大肠杆菌等分并移至预冷 的 E P 管 ，每份 4 0 ul 。
3.5ul T E 中 加 入 I n g 供 体 质 粒 ，然 后 再 加 入 大 肠 杆 菌 中 ，轻 轻 混 勻 。
4•将混合液转到预冷的电转杯中。根据设备说明进行电转。
5•加人 I m l 室温的 S .0. C . 培养液到混合物中。
6.将菌液转到 2m l E P 管 ， 37°C ， 250r/m i n 振荡培养 4 h 。
7.用 S .O .C . 培养液连续稀释菌液至 i 〇-1、 10-2、 10-3。
8•将未稀释的和连续稀释的样品各取 1 〇〇 ul 到 L b 琼脂板上，涂布均匀。
9.将平板置于 37°C 孵 育 24 h 。
板上的克隆带有重组杆状病毒基因组。转座可以通过含有 Bluo/X-gal 和 EPTG 的平板，并将孵育时间延长至 48 h ， 最后通过颜色筛选来确定。
重 组 杆 粒（杆状病毒基因组）D N A 的分离
1 0 .挑 选 克 隆（接 步 骤 9 ) 。在 一 个 装 有 5 ml L B 培 养 液 的 50 ml N u n c 管 中 ，加 入 lOug/ml四 环 素 和 7ug/m l 庆 大 霉 素 和 挑 选 的 克 隆 。
11.37°C， 250r/min 振 荡 培 养 16 h。
为了确定挑选适合的克隆，将克隆均匀涂布在含有 Bluo——gal 和 IPT G 的 LBas-琼脂平板上，37°C 培养过夜。
12.将 Im l 培养物移至新的 I .5m l 管中 ， 14 OOOg 离 心 lm in。
13.弃上清，用 300^1 Boost 溶 液 1 轻轻的反复吹打以重悬细胞。
14.加 入 3 〇 0 Ml Boost 溶 液 2 , 颠倒数次混匀，室温放置 5 min。
15•缓慢加人 SOOfjJ B 00st 溶 液 3 , 边加边轻轻混勻，冰上放置 5m in。
大肠杆菌基因组 DNA 和蛋白质的白色沉淀会在此步形成。
16.14 OOOg离心 l 〇 min。
17•在新的 2m l 管中加人〇.8m l 无水异丙醇。
1 8 . 将上清小心移入到有异丙醇的管子中，要避免取到白色沉淀。颠倒管子数次混勻冰上放置 5m i n 。
19.4°C * 14 OOO 公离心 15m i n。
20.弃上清，每管中加人 lml 7 0 % 乙醇，颠倒管子数次，以清洗沉淀。
21.16℃， M 000』H 5m i n 。
22.弃上清，晾干沉淀。
23.40 ulT E 溶液溶解 D N A , 轻轻振荡使其溶解。
沉淀可以置于冰箱中溶解过夜。如果不直接用于转染，杆 粒 D N A 于一 20-C 保 存 ，避免反复冻融。
重组杆粒 D N A 转染昆虫细胞以生产病毒
2 4 . 在 6 孔培养板的每一个 35m m 孔中接种 I . 5 X 106Sf9 细胞，每孔中加人 2m l 无血清昆虫细胞培养液。
使用成活率大于 97% 处 于 对 数 生 长 期 的 细 胞（IX lO6〜2 X 106 个 ) 。
25.28°C 培养细胞 I h , 使其贴壁。
26.转染试剂的准备
a. 用昆虫细胞培养液稀释 5ul 杆 粒（步 骤 23) , 终体积为 l 〇〇 ul。
b •用昆虫细胞培养液稀释 6u1 Cellfectin 转染试剂，终体积为 IOOml
c•混合杆粒 D N A 和 Cellfectin, 轻轻混匀，室温孵育 20〜45m i n 。
d. 加 入 0.8m l 昆虫细胞培养液到装有脂质体-D N A 复合物的管子中，轻轻混匀。
27•吸去培养板中的培养液，用 I m l 脂质体-D N A 复合物, z 孔覆盖细胞， 28°C 培 养 5 h 。
28•吸去转染试剂，加人 2m l /孔昆虫细胞培养液。 28°G 培养 3〜4d 。
29•将培养上清转到一个无菌有盖的管子中。 500 g 离 心 5m i n 沉淀细胞碎片。将有病毒的上清转移到新的管中。
原代储备病毒在避光条件下可以在 4°C 存 放 6 个月以上，在一70° c 则可以存放更长的时间。
为了获得病毒最长的保存时间，可以在原代储备病毒中加人终浓度为 2 % 的胎牛血清。
30•用噬斑形成法或终点稀释法来测定病毒滴度
二代储备病毒的产生
31•用 m o i 为 〇 • 01〜〇 • 1 的原代储备病毒感染悬浮培养的Sf9 细 胞（1: 名 106 个/m l ，对数生长期） 。
在 这 一 步 中 使 用 低 moi 的 病 毒 去 避 免 有 缺 陷 的 干 扰 颗 粒 的 积 累 是 很 重 要 的 。通 常 的 ， 60ul原 代 病 毒 储 备 液 可 以 制 备 3 〇 ml 的 二 代 储 备 病 毒 。
32.28°C 培养细胞 4d 。
33.IOOOg 离 心 5m i n , 将上清转移到一个新的管子中， 4°C 避光保存。
3 4 •确定二代储备病毒的滴度。
乐 观 的 估 计 二 代 储 备 病 毒 的 滴 度 ≥1 〇 8pfu/ml。
大规模的病毒和蛋白质的生产
35.用 m o i 为 〇. 〇 1〜〇 • 1 (步骤 36) 或 5. 0 (步 骤 3 7 ) 的二代储备病毒感染所需体积的昆 虫 细 胞（I X 1o 6 个./m l)。 28 °C 培养细胞 3 〜 4d 。 下接 步 骤 3 6 或 3 7 。
3 6 . 制 备 用 作 转 基 因 实 验 的 病 毒 。
a . 培 养 物 5000 g■ 离 心 20m in。
b . 将 含 有 病 毒 的 上 清 移 到 一 无 菌 管 中 。浓 缩 病 毒（A ir e n n e e ta L 20 00 ; H aeseleeret al. 2 0 0 1) 。
c• 测 定 病 毒 滴 度 。
3 7 . 重 组 蛋 白 质 的 生 产 。
a. IOOOg 离 心细胞 20m in。
b . 从 培 养 液 或 细 胞 中 纯 化 表 达 的 重 组 蛋 白 质 ，需 要 根 据 重 组 蛋 白 质 的 性 质 来 加 以确 定 。
在重组蛋白质上加入合适的亲和标签可以大大简化纯化的工作（Amau et aL 2006)。
来源：丁香实验
