材料与仪器
步骤
β-半乳糖苷酶表达型扩增载体
材料
试剂
Dulbecco 基 本 培 养 基(D M E M ; G I B C O B R L ) , 无菌、高糖、含 L -谷氨酰胺、无硫 丙 酮 酸( Invitrogene 或其他同类产品)
D u l b e c c o 磷酸盐缓冲液( D P B S ),无菌、无钙离子/镁离子
乙 醇(7 0 % V /V )
胎 牛 血 清(F B S ; 无菌,支原体检查)
戊 二 醛(25%)
铁溶液:
165m g 氰化钾
211m g 亚铁氰化钾
20 mg 的 NP-40 (Tergitol)
I O m g 脱氧胆酸钠
19m g 氯化镁
加人 P B S 使总体积为 100 ml。用锡箔封住瓶口,储存在 4°C 中。
N I H -3T 3 细 胞( A T C C : C R L -1658 )
TE ( 0. 25% 胰酶/0• 02% EDTA; Invitrogen)
水 ,去 离 子 d H 20 ) ,无菌
X -gal原 液( 5-溴-4-氯-3-吲哚令-β-半乳糖苷; 20m g /m l 二甲基亚砜)
仪器
Bioguard 生物安全柜( Baker Steriguard II 或同类产品)
细胞培养 M (24 孔 ; Corning 或同类产品)
细 胞 刮 刀(大号; N u n c 或同类产品)
离 心 管(锥形, 15m l 和 50m l , 无菌; C o m i n g 或同类产品)
C 0 2/H 20 套式培养箱 [ (37±1.0)°C , 5 % C O 2; F o r m a 或同类产品]
培 养 瓶(T -150, 无菌; Corning 或同类产品)
冰箱:标 准(一 20°C ) 和 超 低 温(一 80°C )
血细胞计数板
倒置相差显微镜(Zeiss Telaval 31 或同类产品)
乳胶检查手套(无粉)
微量离心管(〇 • 5m l 和 I.7m l ,无菌; A x y g e n 或同类产品)
微型离心机 (National Labnet C -1200 或同类产品)
微型涡旋振荡器 (V W R 或同类产品)
电动移液器 (D r u m m o n d 或同类产品)
移液器和无菌吸头 (可调体积;Rainin P -20、 P -200 和 P -1000 或同类产品)
一次性移液管 (5m l 、 I O m l 和 25m l 容量,无菌)
水浴锅,(3 7 ± 1 )°C ( V W R 1235 或同类产品)
方法
1•为需要滴定的所有孔预热足够的 T E 和 含 5% 胎牛血清的 DMEM 培养液到 37°C
2 . 在生物安全柜操作,无菌移除细胞里的完全培养基。
3 . 小心用 5m l 无钙离子和镁离子的 D P B S 清洗细胞,去除液体。
4 . 用无钙离子和镁离子的 D P B S I : 1 稀 释 T E 。加 人 2m l 稀释的 T E 到每个 N I H -3T 3细胞瓶里。
5•在室温或 37°C 中孵育细胞直到细胞完全脱离瓶底。每 5m i n 观察一次,轻轻晃动,使细胞脱落。
6 . 加人大约 I O m l 含 5% 胎牛血清的 D M E M 使细胞脱落。小心吹打细胞使悬浮。
7•在 15m l 离心管中,稀释 0. 5m l 悬浮细胞到 4. 5m l 生长培养基中。吹打使完全悬浮。
8 . 加人约 IOm I 悬浮稀释细胞到血细胞计数板。
9 . 计算血细胞计数板每条边上 4m m 2 (四个角的格)的所有细胞。确定每平方毫米的细胞平均密度。用稀释倍数乘以平均密度。对结果再乘以 104。这个数目相当于每毫升原细胞悬液中的细胞数。
10•根据这个细胞数,用预温的生长培养基稀释细胞到终浓度 2 X IO5 个/m l 。吹打混合均匀。
11•加入 0 •5m l 含 5 % F B S 的 D M E M 到 24 孔板的每个孔内。
12.使 用 5m l 的移液器加人〇.5m l 的稀释细胞到每个孔中,最终的种板浓度为每孔 I XIO5 个细胞。
13.37°C 孵育培养板过夜。
转导
14•稀释 1〜5ul 等 分 的 扩 增 病 毒 到 要 滴 定 的 350 ml 预温的含 5% FBS 的 DMEM 中。每管涡旋混合约 Is。
1 5 . 在生物安全柜中操作,无菌地从细胞中除去生长培养基。用准备的病毒悬浮液代替。
16.37°C 孵育培养板 l h 。每 15m m 轻轻摇晃板子均匀分散病毒。
17•在生物安全柜中操作,无菌地加人 400ul 预温的含 5% FBS 的 DMEM 到每个孔中。
18•在 37°C 孵育培养板 20〜48 h (取决于引导β-半乳糖苷酶转基因的扩增所在的启动子)。
转导细胞的固定
19•从培养箱中取出培养板,除去生长培养基。
这一步不需要无菌操作。
20.用 约 Iml P B S 小心清洗每个孔。
21.加入 400ul 11% 的戊二醛到每个孔中。
22•在室温孵育 l O m i n。
23.去除戊二醛。用 Iml P B S 清洗每个孔。
固定的单层细胞可以在 P B S 中 于 4°C 保存直到准备进行组织化学染色,测 定 β-半乳糖苷酶活性。
来源:丁香实验