A d 载体的构建和特征化

A d 载体的构建和特征化

材料

试剂

琼 脂 糖（1 % W )

溶解 Ig 琼 Ss 糖（UltraPure; Invitrogen, 15510-027) 到 IOOml 无菌水中。 i21°C 灭菌 20 min。室温保存，使用前微波炉溶化。

细菌

BJ5 1 8 3 细 胞（RecA -精 通 型）

在 商 业 化 AdEasy 试剂盒中可以提供，详 细 看 表 1。

D H 5a (R ecA -缺 失 型 ；In v itro g en ， 18258-012)

制造感受态细胞，使用氯化铷方法，参 见 Sambrcok 等（1989) 0 .2 m l 分装保存一 8 0℃。

饱和酚溶液

细胞系

低 传 代 的 293 细 胞（M icrobix; T o ro n to ， C anada， PEMD2-01)

A549 细 胞（ATCC; M anassas， Virginia， CCL-185)

培 养 293和 A549 细 胞 在 150mm培 养 板 ， 37℃， 5%CO2 培养箱， 90% 汇 和 ， 1 : 2 或 1 : 3传 代 。

293N 3S 细 胞（M icrobix ， PI>02-02)

如 上 所 述 15 〇 m m 培养板培养 293N3S 细胞。在悬浮培养基中悬浮培养细胞， 70r/m in 振 动 ，当细胞到 5X10⁵ 个/m l 时 ， I : 2 或 I : 3 传代。

氯化铯 梯 度 溶 液（1.25〜1.35 g/m l )

溶 解 分 别 溶 解 54. O g 和 70. 4 g 固 体 氯 化 铯（ Fisher Scientific, B P 1 5 9 5 -1 ) 到 146m l 和129.6 ml 透析液中。 0. 2 叫! 滤器过滤。

氯仿: 异丙醇(24 : I , V /V )

I X 柠檬酸钠

135m m o l / L K C K

15m m o l /L 柠檬酸钠

去离子水溶解， 121°C 灭 菌 45 min。

2X 柠檬酸钠

270m m o l / L K C K

30m m o l /L 柠檬酸钠

去离子水溶解121°C 灭 菌 45 min。

完全培养基

最少的必需培养基（M E M ; Sigma-Aldrich， M 2279)

10% 胎 牛 血 清（F B S ; Sigma-Aldrich， F 2442-500m l )

2m m o l / L G l u t a M A X (Invitrogen, 35050-062)

透析缓冲液（l 〇 m m o l / L Tris-H C K ! > p H 8.0)

去 离 子 水 0.2um滤膜过滤。

D N A 酶 I (Sigma-Aldrich，D-5025)

20m m ol/LTris-HCl (p H 7 .6 )、 50m m ol/LNaCl、 lm m ol/L D T T 和 50% 甘油中溶解lOmg/ml 的 DNA 酶 I。

E B

异丙醇
卡那霉(25ug/m l )

L B 培养基

M g C l 2 (2mol/L )

121°C 去离子水灭菌 45 min。

保持培养基

M E M (Sigma-Aldrich)

5% F B S (Sigma-Aldrich)

2m m o l / L G l u t a M A X (Invitrogen)

I X 抗生素-抗真菌素（Invitrogen)

2X 保持培养基

2 X M E M (Invitrogen, 11935-046)

10% F B S (Sigma-Aldrich)

2X 抗生素-抗真菌素（Invitrogen)

P B S

137m m o l / L NaCl

8.2m m o l / L N a 2 H P 0 4

1.5m m o l / L K H 2P O 4

2.7m m o l / L K C l

去离子水溶解， 121°C 灭菌 45m i n 。

质粒：穿梭和骨架质粒（表 I 和表 2)

限制性内切核酸酶

PacI 限制性内切核酸酶（N e w England BioLabs， R 0547L )

PmeI ( N e w England BioLab, R 05605)

克隆感兴趣基因到穿梭载体可能需要其他的酶。

R N a s e A (10m g /m l ; Sigma-Aldrich， R -4875)

NaCl (5mol/L )

去离子水溶解， 121°C灭 菌 45 min。

去氧胆酸钠 (5% m/V )

0 •2um 滤器过滤。

S D S - 蛋白酶 K 溶液

10m m o l / L Tris-HCl (p H 7. 4)

10m m o l / L E D T A

1 % S D S (m /V )

l m g / m l 蛋白酶 K

S D S (0.1 % m /V ) - T E

溶解 0• Ig SDS 到 IOOml T E 。

蔗糖 (40% m/V )

溶 解 4 0 g 蔗 糖 到 IOOml PBS 溶液中， 0. 2 um 滤膜过滤。

SuperFect 转 染 试 剂（Q I A G E N ， 301305)

I X T E

10m m o l / L Tris-HCl (p H 7. 5)

l m m o l / L E D T A

121°C 去离子水灭菌 45 min。 0 .1 X T E , H2O稀 释 I X 溶 液 121°C灭 菌 45 min。

1 X 胰 酶 - EDTA

PBS 稀释 10X 溶 液（Invitrogen， 15400-054)。

仪器

离 心 机（Avanti J-25 I; B a c k m a n) 和 J L A 10. 500 转 子（B e c k m a n )

热 封 口 仪（如 B e c k m a n Model 7700 Cordless T u b e Topper)

血 球 仪（V W R International， 15170-172)

培 养 箱（37 ℃ ， 5 % C 0 2)

超净台

磁力搅拌器（5 号 ， Bellco Glass， 7785-D 2005)

离 心 管（1.5m l )

移液管，去离子棉塞

1.5% 琼脂胶的培养皿（粒状胶， Fisher Scientific，BP 1423-500) 25ug/ml 卡那霉素 L B 培养基。

Quick-seal (16m m X 76m m 超速离心管；B e c k m a n ， 344322)

Slide——A-Lyzer 透 析 盒（10 OOOkDa 分子质量， 0.5 〜3m l ; Pierce Rockford， Illinois， 664250)

聚 丙 烯 管（13m l 带帽的）

聚 丙 烯 管（5m l )

带 叶 轮 组 片 的 搅 拌 瓶 ： 250m l (Bellco Glass, 1965-61002) 和 3000m l (BellcoGlass, 1965-61030)

注 射 器（3cc) 装 有 22 号针头

超速离心机（如 B e c k m a n Optima X L -I O O K 超速离心机）

70.1 Ti 转 子（B e c k m a n)

S W 41 T i 浮桶式转头（B e c k m a n)

Ultra-Clear (14m m X 89m m ) 超速离心管（B e c k m a n ， 344059)

方法

操 作 A d 必须在达到生物安全水平 2 的实验室进行。专 门 A d 使用的超净台和培育箱。应该小心使用灭菌的仪器、试剂和方法。净化处理固体和液体废物，污染物表面进行消毒。

生产感染性的 A d 质粒

1.使用标准的克隆程序制作包含感兴趣转基因的穿梭载体。

2 . 在 总 反 应 体 系 2(^1，用 1ul 户脱 1 消 化 2ug 穿 梭 质 粒 ， 37℃过 夜 。

3.加 3ul P m e I 消化的穿梭质粒和 3. 3ul 0. lug/ul 超螺旋 p A d E a s y 到 13m l 有盖的聚丙烯管。加 3ul P m e I 穿梭载体不带 p A d E a s y 到另一管作为阴性对照。冰上冷却。

4 . 冰上融化两个 0.2m l 分装的 B J 5183 感受态细胞。

5•加 0. 2m l B J 5183 细胞到 D N A 上 ，冰上孵育 25m i n 。

6.42°C 热 激 90s, 然后冰上放置 2m i n 。

7 . 每管加 1ml LB培养基， 225r/min， 37℃, 温箱孵育 25min。

8•转移细菌到 I.5m l 离心管， 8500 g 室温离心 l m i n 。

9 . 去 除 I m l L B 培养基，总量 0. 2m l 重悬沉淀。

10.加 0. I m l 到 1. 5 % 琼脂胶 L B 25M g/m l 卡那霉素培养板上。一板做对照试验。

在阴性对照板上应该没有克隆。但是，如果背景克隆不出现，重组克隆会明显的比没有酶切的穿梭质粒载体少。

1 1 . 挑 4〜 8 个小克隆，小量碱裂解法纯化质粒 DNA。 悬浮 D N A 到 25ul 0.1 X T E 中。

12.用 5ul D N A 和 IOOlUl D H 5a 重 复 步 骤 5〜1 0 , 而 不 是 用 BJ5183。 每板挑选两个克隆。

13.小量碱裂解法纯化 D N A 。

用不同的限制酶消化 DNA 来验证质粒结构。正确的克隆随后通过 CsCl 密度梯度离心，然后用于产生重组 A d 载 体（步 骤 15)。

细胞准备

1 4 准备用于转染的培养细胞

准 备 贴 壁 的 2 9 3 和 A 5 4 9 细胞

a. 从 培 养 2 兕或 A 549 的 150m m 培养板中去除培养基。

b. 用 5ml l X 柠 檬 酸 钠（293 细胞）或 2m l 胰酶-EDTA (A549 细胞）冲洗单层细胞两次。

c•对于 293 细胞，第二次冲洗之后，去除其余液体，只 留 下 0.5m l 的柠檬酸钠22°C 在 培 养 板 上 5 〜 lOmin, 直 到 细 胞 脱 离 培 养 板 。 A5 4 9 细 胞 ， 2m l 胰酶-EDTA 37°C 孵 育 5 min, 直到细胞开始脱落。

d. 拍打培养板壁，脱落细胞。

e•取细胞到 12m l 完全培养基，分装到新的培养板。
孵育培养板，使细胞在转染前 90% 汇合度。

准 备 293N3S 细胞悬液

a•转移 6 个长满的 150m m 培养板 293N 3S 细胞到 3L 的搅拌培养器中，加维持培养基到 1L。

b•每隔 1〜2d，转 移 2m l 悬浮细胞到 15m l 聚丙稀锥形管中。

c. 加 2m l 的 2X 柠檬酸钠，强烈振荡 l 〇 s。

d.37°C 孵育细胞 15m i n 。

e•强烈振荡 10s。

f . 血清仪细胞计数。

如果细胞成团难计数，继 续 37℃培育振荡，直到细胞散开。

g. 当细胞浓度超过 4X10⁵ 个/ml, 加 IL 保持培养基，直到细胞密度为 3X10⁵〜5X10⁵。

转染和再生 A d 载体

15.用 2ul P acI 消化编码重组 A d 基因组的 IOug 质粒，反应体系 50ul， 37°C 过夜。

16.混合 40M1P acI 消化的 DNA 与 360M1MEM 和 16^1 SuperFect 试剂到圆底的 5m l 聚丙烯管中。

除了 SuperFect 可以选用其他的转染试剂。

17•强烈振荡 l 〇 s。室温放置 15 min, 形成复合物。

18•加 2. 4 ml MEM 到包含 D N A -S u p erF ect 复合物中。吹吸混合。

19.2m l PBS 冲洗 293 细胞接种的 35m m 板两次。

20.转移 0 •7m l 质粒混合物悬液到 3 5 mm 293 细胞板。

21.37°C , 5%C0 2 孵育细胞 3 h。

22•大概 2. 5 h 后 ，微波炉中溶化 1% O n A O 琼 脂 糖 溶 液（每 35 mm 板 最 少 1.5 ml) 。

水浴 42°C 平衡。

23•平衡 2 X 维持培养基（每 35m m 培养板 I.5m l ) 37°C 。

24.3 h 后 ，从转染细胞中去除转染液，用 l m l P B S 冲洗单层细胞。

25.混合等量的琼脂糖胶溶液和 2X 维持培养基。加 3m l 到每一个 35m m 板 293 细胞中。这一步必须快，避免琼脂糖胶固化，但是要轻，避免分散单层细胞。

26•允许覆盖固化（约 15m i n ， 22°C ) 返回细胞到培养器中。

27•孵育直到形成斑（7〜12d)。

28.选择几个分离好的斑。使用灭菌的移液管去除斑上琼脂糖塞。每个塞放到 4 % 蔗糖P B S 瓶中。轻轻振荡， —80℃。保存。

起 始 的 A d 斑分离需要进行二次斑纯化（步 骤 22〜2 8 ) 以确保病毒形成单克隆。分析扩增斑分离的 A d 载体.

29.如上得到的每个纯化的斑载体，加 IOOfiI 到两 个 35m m 长 293 细 胞 板 上（9 0 % 汇合），细胞重新放回培养箱。

3 〇. 允许病毒吸收 I h , 每 10〜15m i n 摇晃培养板。

31•过了吸收期，加 2m l 的维持培养基每板，放回到培养箱中。

32• 检 测 每 板 细 胞 病 变 效 应（C PE ) 。

细胞应该圆球形或从培养板上脱落。用 一 个 培 养 板 分 析 重 组 A d 结 果 。保留其他培养板成分用于扩增。

分析斑点分离的 A d 载体

a. —旦得到完全 C P E ，在超净台中静置 l O m i n ，使脱落细胞沉淀到底部。

b . 小心去除培养基。用 0. 2m l 的 S D S ^蛋白酶 K 溶液重悬细胞。转移细胞悬液到离心管中。

c. 孵育裂解液 37℃过夜。

d•加 0. 3m l T E 到裂解液中。用 0. 5m l 饱和酚溶液抽提，随后用 0. 5m l 氯 仿 ：异丙醇抽提。

e•加 0. I m l 5m o l / L N a C l 和 0. 5m l 异丙醇。

f. 4°C ， 20 000 g 离心 10m i n 沉淀 D N A 。

g. 20〜5 〇 ul T E 重悬 D N A ，取 5〜IOfjJ 用适当的限制性内切核酸酶消化。

h •电泳检测结果条带在 0.8% 琼脂糖上，随后 E B 染色。

扩 增 斑 点 分 离 的 A d 载体

a. —旦得到完全的 C P E (步骤 32)，从培养板上刮取细胞到完全培养基中，转移到 4m l 的冷冻管中。

b •加 4 0 % 蔗糖 P B S 到终浓度 4 % 。轻轻振荡。立即使用或者保存一 80°C 备用。

c. 用 I m l 接 种 I5O m m 293 培养板，细胞放回培养箱培养。

d. 病毒吸收 l h 。每 15m i n 振荡培养板。

e. 过了吸收时期，加 20m l 维持培养基到每板，培养箱中培养。

f. 检 测 C P E 。一 旦 C P E 确定，转移细胞和培养基到 50m l 冻存管。加 1/1 〇量的4 0 % 蔗糖 P B S 到终浓度 4 % 蔗糖， 一 80°C 保存。

大量准备 A d 载体

33•融化接种体 22°C 水 浴。如果需要，可以提高接种体量到 30m l M E M 。

用于贴壁细胞 293 大量准备 A d 载体

a•从 30 个 150m m 培养板的 293 细胞中去除培养基（感染时 约 9 0 % 融和），每次10 个 ， I m l 接种体重新接种。

b. 37°C ， 5 % C 0 2 孵 育 I h 病毒吸收，每 1 〇〜15m i n 振荡。

c•加维持培养基 20m l ，细胞培养箱中培养。

d. 每天检测细胞，直到出现 C P E (2〜3d)。

e. 转移细胞和培养基到两个 500m l 的聚丙稀瓶中

大部分细胞应该在培养基中脱落；没有脱落的细胞可以振荡细胞瓶脱落细胞。

f. 使用相同的枪头冲洗 10 个培养板两次用 I O m l 的 P B S 。

g. 4°C ， 650 g 离心细胞 20m i n 。倒出培养基，保留细胞沉淀。

h •用 3m l 4 % 蔗糖 P B S 重悬细胞，转移到 50m l 冻存管中。

i. 使用相同的吸液管用 2n d 4 % 蔗 糖 P B S 冲 洗 瓶 1 次 ，再 一 次 用 4 〜5m l 的蔗糖 P B S 。

细胞沉淀总量应该在 15 ml。细胞或者直接载体纯化，或者一 80-C 保 存 。

使用悬浮的 293N 3S 细胞大量生产 A d 载体

a•分装 3L 搅拌培养器的 293N 3S 细胞到 8 个 500m l 离心瓶中。

b. 室温 650 g 离 心 20m i n 。倒培养基到 I L 灭菌瓶中。

保 留 I L 用尽培养基，加 人 到 3l 的搅拌器中。培养箱培养。

c. 使用用尽培养基悬浮细胞沉淀，终浓度在 40m l 。转移悬液到 250m l 搅拌器中。

用 I O m l 用尽培养基洗两次，转移到搅拌培养器中。

d•加融化的接种子到培养器中。

容器中总量应该在 100 ml。

e. 转移细口瓶到培养箱， 70r/m i n 搅动细胞 2 h 。

f. 转移细胞到包含 I L 用尽培养基的 3L 悬浮培养瓶中。用 250m l 新鲜维持培养基冲洗 250m l 搅拌培养瓶 2 次，转移到 3L 的搅拌培养瓶中。加 500m l 新鲜维持培养基到终浓度约 2L 。

g•转移 2m l 的 悬 浮 细 胞 到 35_培 养 板 ，放 置 37°C , 5%(：0 2培养箱。

细胞应该重新贴壁到培养板。

h . 放回悬浮培养瓶到培养箱。

i. 当 35m m 培养板出现完全的 C P E 时（2〜如后），倒出悬浮培养基到 5 〇〇 ml 离心瓶中。

j. 4°C ， 650 g 离心 20m i n 。倒去培养基，保留细胞沉淀。

k . 用 3m l 4 % 的廉糖 P B S 重悬细胞，转移到 50m i 的锥形管中。

l. 使用相同的移液器用 2m l 的 4 % 蔗 糖 P B S 冲洗瓶一次， 4〜5m l 4 % 蔗 糖 P B S 冲洗一次。
细胞悬液总量大约 15 ml。细胞或者直接进行载体纯化或者保存在—80 〇 C 。

载体纯化

34.37°C 水浴融化两种方法大量准备的 A d 载体沉淀。
以下介绍的细胞沉淀液总量 15m l, 根据实际量进行放大或缩小。

35.加 1.5ml 5% 去氧皮质酮到沉淀。经常颠倒混合孵育 22°0,3 〇 min。

裂解液为浓的高度黏稠液体。

36.加 0. 3m l 2m o l / L M g C l 2、 0.15 ml 10m g / m l R N A 酶 A 和 0.15m l 10m g / m l D N A 酶 I。

37°C 孵育，偶尔颠倒混合， 30〜60m i n 。

37• —旦黏稠的裂解液接近水， 22°C ， . I O O O g 离 心 l O m i n。

38•准备 C s C l 梯度离心，使 用 Ultra-Clear 超速离心管（每病毒 2 个管）。

a. 每管加 2m l I.35 g / m l C s C U

b. 小 心（如用稳定流速，速率约 30s/m l ) 在上层加入 1.25 g/m l C s C l 。

c•小心加等量澄清裂解液（6. 5〜7m l ) 每管。

d. 平衡每管，转移到 S W 41 转子离心机内。

39•使用慢加速和减速程序（500r/m i n 大 于 5m i n ) 离 心 样 品 10°C ， 35 OOOr/m i n 离心 l h 。

病毒条带是梯度中最低可见条带，在 梯 度 1. 25〜I. 35 g/m l 层 。

40•使用 3c c 针管和 22 针头插到管大约病毒条带下 l c m 。轻轻倾斜，使针头平行条带慢慢移动，条带降低，针头降低。两个梯度管的病毒可以合并到单一的 Quick-Seal 超速离心管中。

41•充满包含病毒的 Quick-Seal 管到瓶颈用 1.35 g / m l C s C U 使用热封口来封口 QuickSeal 管。

准备平衡管使用 I. 35 g/ml CsCl 充 满 Quick-Seal 管到瓶颈。

42.35 O O Or/min 离心用 70.1 T i 转头最大加速最大减速 K T C 过夜。

1. 刺穿封口的 T i 管盖，形成空气人口。使 用 3c c 和 2 2 号针头刺穿管在病毒下 I o n 。

   斜成斜面，使它平行条带，慢慢移动，条带降低，降低针头。
   小心，最小量提取。

   44.A d 往入准备好的透析盒中。用针头去除空气。

   45.用 500m l 透析缓冲液 4°C 透析 A d 载体 2 4 h 。

   46.从透析盒中转移载体。保留注射器和〇.9m l 透析缓冲液。

   47•加 4 0 % 蔗 糖 P B S 到载体中，以及终浓度 4 % 的透析液。保存纯化载体小量分装(100〜2(%1) —80°C 和缓冲液在一 2(T C 。
   A d 载体储存液在一 8 〇 。 < ：稳定数年。

   鉴定纯化的 A d 载体

   48.进一步鉴定 A d 载体通过分析基因组结构、检测滴度、检测是否有复制能力的完全腺 病 毒（R C A ) 污染。

   确 定 纯 化 的 A d 载体基因组结构

   a. 冲洗从裂解液中转移载体的注射器，使 用 〇_2 ml S D S ■蛋白酶 K 。转移液体到L 5m l 的 离 心 管 中 。

   b. 37°C 孵 育 过 夜 。

   c•加 0. 3 m l T E 到裂解液中。用 〇 • 5m l 缓冲液饱和酚，随 后 〇.5m l 氯 仿 ：异戊醇提取。

   d•加 0 • I m l 5m o l / L N a C l 和异丙醇。

   e. 4°C ， 20 000 尽 离 心 IOmin 沉 淀 D N A 。

   f. 用 20〜50^x1 T E 重悬 D N A , 取 5〜lO/xl 用适当的限制性内切酶消化

   g. 0 . 8 % 琼 脂 糖 电 泳 检 测 酶 切 条 带 ， 随 后 E B 染 色 。

   确定感染单位滴度，通过使用斑形成单位（Pfu) 分析

   a. 准备在 M E M 中系列稀释的 A d 载 体（10—4〜I( T s)。

   b•用 0.1m l 每个分装稀释液感染 6 孔板中的 293 细 胞（约 9 0 % 汇和），细胞放回到培养箱。

   c•病毒吸收 l h ，每 10〜15m i n 振荡培养板。

   d•过了吸收期，如前所述铺琼脂胶。

   e•孵育 10〜12d ，计数斑点。

   每孔斑点数量乘以稀释因子决定载体滴度 pfu/ml。

   用粒子/m l 测定载体滴度

   a. 用 Iml 0 •1 % S D S ——T E 稀 释 20〜50M 1 纯载体到终体积 I m U

   使用透析缓冲液（步骤 4 6 中）作为空白对照。

   b. 56°C 孵 育 I O m i n , 轻轻振荡，轻轻离心。

   c. 测定 O D 2m。

   d. 计算数量粒子/m l , 野生型 A d 消光系数 1.1 X I O 12 (MaizeletaL 1968):

   (O D 2w) (稀释 因 子）（I . I X l O 12)

   如所述标准的 A d 载体应该粒子数对 p fu 比例大概在 10 (Mittereder et al. 1996)。

   检测在准备的纯化载体中是否有 R C A 存在

   载体 D N A 和 293 细胞或 911 细胞中的 A d 5D N A 重组可能会导致转移 E l 到载体上(Lochmuller et al. 1904)，产 生 R C A 。 A 549 不能表达 E l 从而不能有效地支持 E l缺失的载体复制。因此，用纯化的 A d 转染，一旦污染有 R C A ，会 在 A 549 细胞中引起 C P E 。

   a. 用 250u l M E M 溶解的 IO6Pfu 感 染 60m m 板 的 A 549细 胞 （9 0 % 汇合）。另一个60m m 培养板用 l〇 7pfu 250^x1 M E M 溶解。用 I m l M E M 溶 有 IO8Pfu 载体感染150m m 培养板。细胞放回培养箱培养。

   b.病毒吸收 l h ，每 10〜15m i n 振荡培养板。

   c. 过了吸收期，加 5m l 或者 20m l 维持培养基每板，放回培养箱。

   d. —旦有明显 C P E 或 者 7d 后 ，通过刮取细胞到培养基收获单层，加 4 0 % 庶糖P B S 到终浓度为 4 % 蔗糖，保存在一 8 〇° C 。

   e•使用 I m l 培养基溶解收获的病毒感染单独的 150m m A 549±音养板。加 lm l M E M到第四板作为阴性对照。

   f•病毒吸收 l h ，每 10〜15m i n 振荡培养板。

   g. 过了吸收期，加 20m l 维持培养基到每板，放回到培养箱。

   h . 观察是否形成 C P E 每天对照感染细胞和未感染的对照。如果需要，每 5d 更换培养基。

   如果出现明显的 CPE (通常会转染约 W d 后出现)， RCA 存在于纯化的储存液中。 R C A 对pfu 的相对量可. 以通过对比 3 个感染板上的 CPE。L 从出现 C P E 的培养板上提取 DNA。限制酶消化琼脂糖电泳分析。左边末端的 RCA 基因组会有结构与野生型 A d 相 同 ，因 为 有 E l 存在。