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基本方案2 直接 Southern 杂交检测异常扩增和甲基化实验

相关实验：脆性 X 综合征的分子分析实验

最新修订时间：

材料与仪器

基因组DNA
5 X 限制性缓冲液 10 X Ficoll载样缓冲液 1 X TAE 缓冲液 变性缓冲液 转性缓冲液 中性缓冲液 杂交缓冲液
Whatman 3MM 滤纸 Nytran SuPercharge Turboblotter Rapid Downward Transfer 系统和膜 烤炉 杂交炉 uv 透明塑料薄膜

步骤

1•做好标记的I.5m l 微量离心管中加入约10叫基因组D N A 。用灭菌水加至总体积 2〇4 (基因组D N A 会比较黏滞，因此精确测量体积会较困难） 。以灭菌水加至总体 积 29^1。以移液枪打匀。不要振荡。 2. 按以下顺序加样： 8jul5X限制性缓冲液； 0. 4|ul0. lmol/L D T T ； 0. 4|ul 3U/jnl RNaSe A 。 3 . 每管加入IlLtl (IOOU) Ec0R I 和 IjuI (50U) E a g I (限制酶酶切图见图9.3. 2)b 以最大转速离心2s以确保各组分混合。 37°C孵 育 过 夜 （ 16〜20h)。 4 . 加 知 llOXFicoll载样缓冲液，振荡，点离。 5. 将 样 品 （ 总体积4〇4左右）加 至 U c m X IlcmXO• 弓 cm 大小0.8% (肌斤）的琼脂糖 凝胶的0. S c m X l O c m 点样孔中，琼脂糖凝胶含O J S jUgAnl溴化乙锭，置 于 I X T A E 缓冲液中。 6. 琼脂糖凝胶在I X T A E 缓冲液中以1.2V/cm进行电泳，直至染料前段到达凝胶边 缘 ，需 过 夜 （ 通 常 18h左右） 。 7 . 把琼脂糖凝胶在变性缓冲液中孵育两次，每 次 3〇 min。以转化缓冲液清洗凝胶
1 5 min 。 按 照 生 产 厂 商 要 求 , 用 Turboblotter Rapid Downward Transfer System 将 D N A 转至Nytran膜上。 8. 10〜20m l 杂交缓冲液中60°C 无探针预杂交6〜18h。 9•利用寡核苷酸标记试剂盒，将 3000Ci/mmol [cr32P] d C T P 与 Cr32P 标记的StB混合 至 IO6CpmAig左右。通过煮沸变性约5 0 n g 标记探针，再置于冰上。将杂交缓冲液稀 释至5X 106cpm/m l 并以此代替预杂交缓冲液。以 60°C 杂交18〜20h。 10. 以10〇11112父33?£/0.1%303洗膜5111丨11，室温。换成1父88?£/0.1%303室温孵 育 5min。再换成125m l 预热的〇 • 1 % SSC/0. 1 % SDS 30°C 孵 育 60min。室温下以 2X SSPE清洗杂交膜。 11. 将膜吸干，包入U V 透明塑料薄膜，一70°C自显影1〜10d。

来源：丁香实验

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