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脆性 X 重复片段的 PCR 扩增

相关实验：脆性 X 综合征的分子分析实验

最新修订时间：

材料与仪器

10 X PCR 扩增缓冲液 dNTP 混合物 DMSO (Sigma) Taq 酶 pH7. 5 TE 缓冲液 0.67 X 和 2. 8X TBE 缓冲液 载样液 2 X SSC 快速轻便杂交试剂
快速轻便基因组作图探针试剂盒 循环热反应仪 水浴锅 垂直凝胶电泳设备 无粉手套 正电荷尼龙膜 电转染设备 真空炉

步骤

1•按以下组分在1.5m l 微量离心管中准备每次P C R 反应混合物（ 为保证足量， < 2 0 个 样品准备n+ 1 份 ，> 2 0 个样品则准备n+ 2 份） ： IfjJ I O X P C R 扩增缓冲液（ 终浓度为I X ); 0. 3jul25mmol/L MgCl2 (终浓度为 0. 75mmol/L ); 0• 如1 10mmol/L dNTP 混 合 物 （ 各 dNTP 终浓度为 2 ( % mol/L ); 5|ul lOjumol/L 的引物 1 (终浓度为 〇.5jumol/L ); 5jul lOpmol/L 的引物 3 (终浓度为 0. Spmol/L ); IjlJ D M S O (终浓度为 10 % ) ; 0. 05pl 5U/ml Tag D N A 聚 合 酶 （〇.25U ); 4. 85^ H 20 。 2.取 9jul上述P C R 反应混合液至标记好的〇.2m l 微量离心管管底。 3•稀释样品D N A 至 3〇〜lOOng/y ，振荡，每 个 P C R 反 应 加 1^1 D N A (50〜IOOng D N A 可有较好扩增） 。 4 . 将样品置入P C R 反应仪中，按以下条件进行扩增 起始步骤： 4min 94°C (加热) 3 0 个循环: Imin 94°C (变性) Imin 63°C (退火) 2min 72°C (延伸) 5. 在一小型垂直电泳设备上（ 如 B R L V 15.17;附录3F) 准备含8.3mol/L 尿素的6 % 的变性聚丙烯酰胺凝胶。或者准备使用SequaGel-6。在 0. 6 7 X T B E 缓冲液中，以约
500V 恒定电压预电泳30min左右。 6.每个P C R 产物取2〜4jul与 2 倍体积的载样缓冲液混合，并振荡混匀。置样品于 100°C水浴lmin，然后置于冰上（ 或 4°C)。 上样，其中包括两孔〇.4nCi32P 标记的 D N A 分子质量标记。 7•在0.67X T B E 缓冲液中，以 500V 恒定电压电泳90min左右。电泳完成后，将胶修 整至12c m X 16c m 大小，以适应预先切好的膜片。 8. 戴无粉手套，在凝胶上覆盖一张塑料薄膜。以铲板抬起凝胶一侧，使其与塑料薄膜 黏附，然后将凝胶转移至薄膜上。塑料薄膜一侧朝下，凝胶一侧朝上，将凝胶展平 放好。将带正电、预 先 切 好 （ 12cmX 1 6 c m ) 的尼龙膜盖在凝胶上，避免产生气泡。 以 2. 8X T B E 湿润三张滤纸，放置在胶上。 9. 把电转仪的下面部分置于纸上，翻转，使凝胶面朝上。将凝胶上的塑料薄膜移除。 在胶上放置三张2. 8X T B E 湿润的滤纸以完成整个三明治夹心。小心转动移液枪枪 头除去三明治结构中的任何气泡（ 重要） 。放置电转设备的上部于三明治结构上。根 据生产厂商要求，以 3m A /cm2恒定电流电转30min。 10. 将尼龙膜与三明治结构分离， D N A 面朝上，放置于0.4mol/L N a O H 湿润的Whatm a n 3M M 滤纸上，静置约lOmin。 11. IOOml 2X S S C 溶液洗膜5min。以 Whatman 3M M 滤纸吸干，将膜置于80° C 真空 炉 15min。 12. 探针杂交参照Quick-Lite Hybridization及 Genome Mapping试 剂 盒 （ 或者参照单元 9. 4 的基本方案1 ) 如下。 a•开始前将所有洗脱溶液预温至55°C 。 b.35ml 55°C 洗脱液I 中将膜预湿5min。 c. 除去洗脱液I ，加 人 30m l 杂交液及4 4 以碱性磷酸酶标记的（ C G C )n 探针。 55°C 杂交 20min。 d. 50m l 洗脱液I 55°C 洗脱20min。倒去溶液。 e.50ml 洗脱液 n 55°C 洗脱 20min。 f. 室温下，以 50ml IX Quick-Light缓冲液清洗两遍，共 5min。 g. 将膜置于塑料袋中，一侧封口。以 Lumi-Phos喷 6〜8 次。 13. 将塑料袋中气泡除去，封口，清除塑料袋外侧多余的Lumi-Phos。 37°C 曝光X 线 片适当的时间（ 根据探针使用的量）

来源：丁香实验

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