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    在 单 核 细 胞 和 巨 噬 细 胞 中 培 养 HIV

    相关实验：HIV 的检测与分析

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

    基 本 方 案 单 核 细 胞 来 源 的 巨 噬 细 胞 培 养 和 H IV 感染

    药物或生长因子的加入时间依试剂及实验方案而定，单核细胞通常在分离的当天加入 ，成熟的单核细胞来源的巨卩蜜细胞（monocyte-derived macrophages， M D M ) 则在H I V 感染前、感染时或感染后加入。

    材 料

    亲巨噬细胞的H I V -I 病 毒 株 （亲 M 株 ，实验室保存品，见 辅 助 方 案 1 ，或原代分 离 ，见辅助方案2) M DM ， 分离后5〜7d， 经贴壁或淘选纯化（单 元 8. 5)，培 养 在 2 4 孔板或 25cm2 或 80cm2的培养瓶内 PBS (如 Life Technologies 公司生产的）含 1 %FBS V 含添加物的Iscove’ s/RPMI-1640培养基 连接到真空抽吸系统的吸头 1.8m l螺 口 冻 存 瓶 （如 Nunc) 1 . 感染前，将所需量的H I V -I 冻存品在层流柜内室温下解冻。 2 . 对 于 培 养 在 2 4 孔 板 或 25cm2 或 80cm2培 养 瓶 内 的 浓 度 为 0.5 X IO6〜 I X IO6个细 胞/ml的 M D M ，加 入 H I V -1 使 T C I D 5。为 每 毫 升 IO5〜IO6感 染 单 位 （I U ) 并 孵 育 2 〜4h 。每次实验设置一个不加H I V -1 的 M D M 对照。 对 于 浓 度 为 I X l O 6 个 细 胞 /m l的 M DM ，相 当 于 感 染 复 数 （MOI) 为 每 个 细 胞 0.1〜 1 . 0 感 染 单 位 。 HIV-I 的 滴 度 可 以 按 照 辅 助 方 案 2 测 定 。 为 了 达 到 M D M 的最 佳 感 染 ，建 议 M O I 为 0 . 1 〜 1.0。 然 而 ，根 据 实 验 性 质 ， 也 可 以 使 用 更 高 或 更 低 MOI 的 HIV-I 0 另 外 ，可 以 用 热 灭 活 的 HIV-I (60°C ， 30〜 60min) 感 染 M D M 作 为 对 照 。灭活 的 病 毒 储 存 品 应 该 检 验 病 毒 是 否 真 正 被 灭 活 ，常 用 D N A 酶 处 理 （10U /ml) 热灭活 的 HIV-I 后 ，再 感 染 M D M 并 培 养 48h 后 用 PCR 检 测 裂 解 液 以 确 认 HIV-I 在 MDM 中 没 有 复 制 。 3 . 从贴壁 的 M D M 细胞培养体系中移除病毒，温和地吸走所有培养基，不要扰动细胞， 用连接真空抽吸系统的吸头吸取。要洗去残留的病毒，需仔细加人预温的PBS/FBS (24孔板每孔加lml，或者每瓶加10ml)，再温和地吸去。重 复 洗 1 次 。 4 . 用预温的含添加物的Iscove’ s/R P M I -1640培养基洗1 次以去除P B S /F B S 。加人培养 基保持细胞浓度在0. 5 X IO6〜I X IO6个细胞/m l 并补足所用的生长因子和药物。 5 . 培 养 M D M ，每 5〜7d 更换培养基，换液时先吸出一半的培养基，再补加新鲜的培养 基和所用的生长因子及药物。收集吸出的培养上清并储存于一70°C 直 至 检 测 P2 4 抗 原或反转录酶活性以测定病毒产量（单 元 9. 4)。 通 常 ， 当 M O I为 0.1〜 1 . 0 时 ，在 感 染 后 1 〜 6d 可 以 在 M D M 上 清 中 检 测 到 少 量 的 病 毒 产 生 。 HIV-I 抗 原 或 反 转 录 酶 活 性 逐 渐 增 加 并 在 第 10 〜 21d 达 到 高 峰 。在 某 些 培 养 物 中 ，感 染 后 3 个 月 还 能 检 测 到 病 毒 产 生 。 6 . 终 止 M D M 培养后，用适当的缓冲液裂解细胞并进行进一步的分子生物学或生物化 学 分 析 （单 元 9. 5)
    备 选 方 案 用 H IV 悬液感染单核细胞来源的巨噬细胞 附 加 材 料 （其他材料见基本方案） 、 经 贴 壁 或 淘 选 纯 化 （单 元 8. 5 ) 的 M DM ， 并 培 养 5 〜 7d， 培 养 在 15ml、 30ml、 60ml 的 Teflon 罐 子 内 （如 Savillex) 15m l和 50m l聚丙烯锥形管 Beckmarx离心机及G H -3. 8 转子 ，或与其相当者 1 . 用移液器的枪头温和地搅动细胞。将 M D M 和 培养基从Teflon罐 子 转 移 到 15m l 或 50m l 聚 丙 烯 锥 形 管 ，室 温 下 ， 500g 离 心 7min。计 数 细 胞 （附 录 3A ) 并以 0. 5 X 106〜I X l O 6个细胞/m l 的浓度重悬于含添加物的Iscove’ s 或 R P M I -1640培养 基中。 2 . 将M D M 培养物平均分配到两个Teflon罐子中，因 此 罐 子 是 半 满 （不 要 超 过 2/3)。 为了检测各种制剂（如抗病毒药物、细胞因子）的效应，可将培养物分装到适当数 量的罐子中。将盖子松松地盖上。 处 置 Teflon罐 子 时 必 须 特 别 小 心 以 避 免 塑 料 移 液 器 或 枪 头 将 其 刮 伤 ，而且必须 用 温 和 的 洗 涤 剂 （如 用 于 组 织 培 养 的 7X 无 毒 洗 涤 剂 ； ICN) 仔 细 地 清 洗 并 充 分 地 冲 洗 以 防 止 洗 涤 剂 滞 留 在 表 面 或 刮 痕 处 。 Teflon罐 子 必 须 进 行 常 规 性 的 基 础 硅 烷 化 处 理 ，并 且 每 次 使 用 前 要 在 烤 箱 中 处 理 （180°C 、 4h) 以 去 除 内 毒 素 。 3 . 当解冻H IV -I储存品时，将 M D M 及培养基转移到 15m l或 50m l聚丙烯锥形管中， 室 温下， 500g 离 心 7min。 4•吸去上清，按 照 M O I 为 0.1〜1.0 IU/细胞，将亲巨噬细胞H I V -I 病毒株加入M D M 沉 淀 （未感染M D M 作为对照）。温和且充分混匀后将培养物转移到适当大小的TefIon罐子中。 5. 2〜4h 后 ，将 H IV 感染和未感染的M D M 转 移 到 15m l或 50m l聚丙烯锥形管中，室 温下， 500g 离 心 7min， 以去除残留的病毒。吸去上清，加 入 P B S /F B S ，重 复 2 次 洗涤细 胞 。用 含 添 加 物 的 Iscove’ s/RPMI-1 6 4 0 培 养 基 再 洗 一 次 ，并 将 M D M 以 0. 5 XIO6〜IX IO6个细胞/m l 的浓度重悬于新鲜培养基中。 6 . 培 养 H I V 感染和未感染的M D M 直到进行所需要的检测为止。每 5〜7d 更换培养 基 ，换液时，先离心，吸出一半的培养基，再用预温的新鲜培养基补充。将吸出的 上 清 用 Iml冻存管储存于一70°C 用 于测定其p2 4 抗 原 的含量或反转录酶活性（单元 9.4)
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    来源：丁香实验

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