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外 周 血 中 H IV 的 分 离 和 定 量 检 测

相关实验:HIV 的检测与分析

最新修订时间:

材料与仪器

步骤

外 周 血 中 H IV 的 分 离 和 定 量 检 测

基 本 方 案 1 外 周 血 中 H IV 的培养以及通过 TCID 定量来测定其滴度

注 :所有的培养都在 37°C ,含 5 % 0 3 2 的加湿培养箱中进行。

材 料(带 V 项 目 见 附 录 1)

来 自 正 常 个 体(H I V -血清反应阴性)及 感 染 个 体(H I V -血清反应阳性)的全血

无菌 P B S , p H 7.2,或 H B S S

Ficoll-Hypaque 溶液

含 2 ug/p l 植 物 血 凝 素(P H A ) 或 5 % (V A 0 人 IL- 2 的 R P M I -I O 完全培养基

肝 素 钠 真 空 试 管(附 录 3 G )

Sorvall R T -6000 离 心 机 及 H -1000B 转 子(或与其相当的离心机和转子),并配备可以离心培养板的托架

50m l 聚丙烯离心管,无菌

2 4 孔微量滴定板,无 菌(Falcon)

1 . 将 H I V -血清反应阴性供者的全血收集到含有肝素钠(浓度< 2 0 U /ml) 的无菌真空
试管中。血样在室温保存并且在 4 h 内进行处理。每 毫 升 全 血 的 P B M C 预 期 得 率 为 I X l O6 〜 2 X 106 个 细 胞
2 . 用无菌的PBS (pH 7 . 2 ) 或 H B S S 将 血 样 1 : 1 稀释。在 无 菌 的 50m l 离心管中,将 4 体积的稀释血样铺于1 体积的Ficoll-Hypaque溶液上面,使分层。 3•室温, 400g 离 心 20miri。收集血浆/Ficoll-Hypaque交界面的P B M C (图 8.L 1)。用 3〜4 体 积 的 P B S 或 H B S S 稀释。 4 . 室温或4°C , 200g 离 心 5min。弃上清,用 P B S 或 H B S S 装满试管并将细胞重悬。温 和地涡旋混匀,重 复 2 次 ,总共洗涤3 次。 5 . 用 含 2^xg/ml P H A 的 R P M H O 完 全 培 养 基 重 悬 细 胞 ,并 调 整 P B M C 的浓度为 I X l O 6〜2 X 106个细胞/ml (附录3A )。培 养 48〜72h ,在 步 骤 1 0 前 ,将细胞重悬于 含 有 IL-2的培养基中,浓度为4 X 106个细胞/m l 。 6 . 按 步 骤 1 ,将 H I V -血清反应阳性供者的全血> 5 m l 收集到含肝素钠的无菌真空试 管中。 7 . 将血样以400g 离 心 5min,温和地吸取血浆,注意不要扰动细胞沉块。将血浆保存 在冰上以用于步骤I l b 的 分 析 (4h 内使用)。 8 . 用相当于原始血样2 倍体积的无菌P B S 或 H B S S 重悬细胞。在 50m l 的无菌离心管 中,将 细 胞 悬 液 仔 细 地 铺 在 15mlFiC〇ll-H ypaque溶 液 上 面 (室 温 ),不 要 扰 动 界面。 9 . 按 步 骤 3 和 4 , 收 集 P B M C 并 重 悬 于 3m l 含 5 % 人 IL- 2 的 R P M I -I O 完全培养基中。 用血细胞计数器计数细胞。 10. 将 步 骤 5 中 经 P H A 刺激的供者T 淋巴母细 胞 铺 于 2 4 孔微量滴定板中的1 2 个 孔 , 每孔的细胞量为2 X 106个 。 11a. PBMC中 H IV 滴度的测定:将 步 骤 9 的 HIV-血清反应阳性的PBMC按如下浓度 加 入 5 个孔中: 2 X 106、 2 X 105、 2 X 104、 2 X 103和 2 X 102个细胞/孔 。在 第 6 孔 中不加入PBMC (0个细胞)作为阴性对照。 lib. 血 浆 中 H I V 滴 度 的 测 定 :将 步 骤 7 的血浆按如下的量加入剩余的孔中: 1000、 200、 40、 1 0 和 2^1/孔 。在最后一孔中不加血浆(0卜1)作为阴性对照。 未 使 用 的 血 浆 可 储 存 于 一 70°C ( 用 于 培 养 ) 或 者 4°C (用 于 抗 体 检 测 )。 12•向每孔中加入含5 % 人 IL-2的 R P M I -10完全培养基,终体积为1.5m l ,孵 育 24h 。 13. 将组织培养板放入培养板托架中,室温, 200g 离 心 5min。将每孔的培养上清弃掉 I m U 补 加 I m l 新 鲜 的 含 5 % 人 IL- 2 的 R P M I -10完 全 培 养 基 ,再次离心。重 复 2 次 ,总共洗涤3 次 。 14. 维持培养< 1 4 d ,每 周 更 换 2 次培养基,更换培养基时将组织培养板在200g 离心 5 m i n 。 将每孔的培养上清取出I m l 并保存于一 70°C ,加 入 I m l 新 鲜 的 含 5 % 人 IL-2 的 R P M I - 1 0 完全培养基继续孵育。 15•检测上清中p2 4 抗 原 的 含 量 (单 元 9. 4)。如 果 上 清 中 HIV p2 4 抗原的浓度在2 次 连续测定中均超过200pg/m l, 或 单 次 测 定 时 超 过 l 〇〇〇pg/m l, 则认为该培养物是 H IV 阳性的,并终止培养。将 p2 4 阳性上清分装成小份储存于一70°C 。 16.对 HIV p24阳性孔进行分析,找出其中PBMC含量最少或血浆体积最小的那一孔, 其 PBMC或血浆的量即为终点值。将病毒滴度结果表示为每IO6 PBMC或每毫升血 浆的组织培养感染剂量(tissue culture infectious dose, TCID) 〇

基 本 方 案 2 感 染 同 种 异 型 T 淋巴母细胞:原 代 分 离 PBMC 中 的 HIV

材 料

T 淋巴母细胞,来 源 于 H I V -血清反应阴性血样(见基本方案1) P B M C ,来 自 H I V -血清反应阳性的血样(见基本方案1) V R P M I -10完全培养基含或不含5 % 〜1 0 % IL-2 (用量取决于其纯度;表 5. 0.1) 冷冻台式离心机 1 . 按基本方案1 中的步骤1〜5 , 从 H I V -血清反应阴性的血样中制备T 淋巴母细胞。 2•将所得的T 淋巴母细胞用RPMI-1 0完全培养基洗涤2 次并 以 0. I X I O 6〜I XI O6个细 胞/m l 的浓度重悬于含5 % 〜1 0 % IL- 2 的 RPMI-10完全培养基中。 3 . 按基本方案1 中的步骤6〜1 0 , 从 HIV-血清反应阳性的血样中制备PBMC。 以 I X IO6 P B M C /m l的浓度重悬于含IL- 2 的 RPMI-10完全培养基中。 4 . 将 来 自 HIV-血清反应阳性血样的I X l O 6 PBMC加 入 5 X 106 (IOml) 同种异 型 T 淋 巴 母 细 胞 中 (常用比例为1 : 5〜1 : 10)。 5 . 将 ?已^1(: /丁 淋 巴 母 细 胞 在 含 5%〜 10%11^2的 11?¥1-10完 全 培 养 基 中 进 行 共 培 养 ,并用倒置显微镜监测合胞体的出现(对于某些供者的P B M C 培养 物 ,即使病毒 能进行有效的复制,也可能不出现明显的合胞体)。 6 . 从 第 3 天开始,每 2〜3 天收 集 5 0 % 的培养上清,并补充新鲜的含5 % 〜1 0 % IL-2的 R P M I -10完全培养基,直到感染后第1 5 天 。将上清储存于一70°C 直至所有样品收集 完毕。 7 . 从共培养开始算起, 2 〜 4 周 内 检 测 上 清 中 病 毒 的 产 量 ,即 测 定 P2 4 抗原的产量 (E L I S A ) 或 反 转 录 酶 活 性 (单 元 9. 4)。 8 . 选择病毒产量最高的上清作为H I V 的供源。如 果 2 或 3 个时间点的上清有相同的最 大病毒产量,则将其合并同时测定其病毒滴度(图 9. 2.1)。 培 养 2〜3 周后添加新的T 淋巴母细胞引起H I V 的新一轮播散,可以增加培养 上清的病毒滴度。

来源:丁香实验

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