外 源 性 抗 原 向 T 细 胞 的 呈 递

基本方案 一 种 抗 原 加 工 处 理 和 呈 递 的 检 测 体 系

材 料

具有增殖能力的（如转化的 B 细胞）或非增殖的且与 T 杂交瘤细胞 M H C 匹配的抗原呈递细胞（单 元 7.1)

D M E M -1 0 完全培养基， 37°C

对数生长期的 T 杂交瘤细胞

抗原：溶解于水的蛋白质或多肽（对于难溶于水的多肽，需要用 DMSO 溶解且需设置溶剂对照）

IL-2 E L ISA 试 剂 盒（如 Genzyme) 或见单元 5. 1

9 6 孔平底培养板

Sorvall RT- 6 0 0 0 冷冻台式离心机及 HB-IOOO 转子

0.22um 低蛋白结合性滤膜，仅用于多肽过滤

多道移液器及无菌枪头

la. 对于非增殖的抗原呈递细胞：将分离的腹腔细胞或其他非增殖或低增殖的细胞加入9 6 孔平底培养板， 2 X IO⁵ 个细胞/孔 ，用 D M EM -IO 完全培养基将液体量调节为 lOOul/孔。

Ib. 对于具有增殖能力的细胞株：用 D M E M -10 完全培养基制备 B 细 胞 悬 液（5 X I O ⁵个细胞/ml) ，将细胞加入 9 6 孔平底培养板， 100ul/孔（5 X I O ⁴ 个细胞/ml)。

2 . 室温， 400〜500 g 离心收集处于对数生长期的 T 杂 交 瘤 细 胞（5 X 10⁵〜IO⁶ 个细胞/m l ) , 将细胞悬浮于预热的 D M E M - 1 0 完全培养基，计 数 细 胞（附 录 3A )，将细胞浓度调节至 2 X 1 0⁶ 个细胞/ m l 。 加 入 50ul/孔（IO⁵ 个细胞/孔）至含有抗原呈递细胞的9 6 孔平底培养板，置 于 37°C 培养或立即进行步骤 3 操作。

3 . 制 备 lmmol/L 蛋 白 质 或 多 肽 储 存 原 液 。将 合 成 的 多 肽 溶 解 于 去 离 子 水 中 ，用0.22um 低蛋白结合性滤膜过滤（可 储 存 于 4°C 数月）。对于蛋白抗原，可于使用前溶解于 D M E M -10 完全培养基。

4 . 用 D M E M -10 完全培养基作连续梯度稀释抗原，可根据浓度需要设计稀释的梯度，抗原浓度需要大于终浓度的 4 倍以上。

5.将 50ul/孔抗原加入到含有抗原呈递细胞和 T 杂交瘤细胞的 9 6 孔平底培养板。每个抗原浓度设三个复孔，以 及 一 系 列 空 白 对 照 孔（加 入 50ul/孔 D M E M -10 完全培养基）。继 续 置 37C 培 养 20〜24 h 。

抗 原 、抗 原 呈 递 细 胞 和 T 杂 交 瘤 细 胞 可 按 照 任 意 次 序 加 入 。

6.400〜500 g离心培养板 I O m i r u 用多道移液器将 1 〇〇ul/孔上清转移至一新的圆底 96孔板。将原培养板一 20°C 保存以便在 IL-2 检测出现问题时备用。

7.— 80°C 冻 存 I h 或 一 20°C 冻 存 过 夜 以 便 灭 活 混 入 上 清 的 活 细 胞（培养板可冻存于一 20°C 数周后使用）。检测上清中 IL- 2 的 水 平（单 元 5.1)。

备 选 方 案 1 用固定后的贴壁型抗原呈递细胞检测加工处理过的抗原肽

此方案可用于检测 M H C I 类分子途径或 M H C II 类分子途径呈递给 T 杂交瘤细胞的抗原肽。

附 加 材 料

D M E M 培 养 基（无血清）

溶解于 P B S 的 2 % (m A O 多聚甲醛溶液

赖氨酸洗液

la. 对于贴壁的腹腔巨噬细胞：将分离的腹腔巨噬细胞以 2 X 10⁵ 个细胞/孔 加 入 到 9 6 孔
平底培养板，用 D M E M - I O 完全培养基将液体总量调节至 100ul/孔 。 37°C 培 养 2 h使细胞贴壁。

lb. 其他贴壁的抗原呈递细胞：将细胞以 2 X 10⁵ 个细胞/孔加入到 9 6 孔平底培养板，用D M E M -10 完全培养基将液体总量调节至 100ul/孔 。 37°C 培养足够的时间使细胞贴壁。对于需要过夜培养以贴壁的细胞株，细胞浓度需低 2〜4 倍以便细胞增殖。

2 . 用多道移液器吹打悬浮细胞，一次吸弃一排或多排培养板孔的上清并立即加入无 1清 D M E M 100ul/孔 。其余的细胞同法处理。

3 . 将 2 % 多聚甲醛溶液与无血清 D M E M 等 量 稀 释（多聚甲醛浓度为 1 % ) ，立 即 进 入 步骤 4 操作。如 果 在 后 续 步 骤 中 出 现 固 定 液 毒 性 问 题 ， 可 将 多 聚 甲 醛 以 0. 5 % 稀 释 于 D M E M 。

4 . 将培养板中细胞培养液替换为固定液（IOOul/孔）。 室温孵育 1 〇 〜15 min。

5 . 用多道移液器吸弃固定液，加 入 120ul/孔 D M E M ，为了防止固定液残留，移液器头应避免接触孔壁且避免溅出。吸 弃 D M E M 并 加 入 赖 氨 酸 洗 液（120ul/孔）。室温孵育 20〜30 min。

6 . 用 D M E M 洗 板 4 次（D M E M 用量应逐渐加大，如前面两遍可加入 150Ul/孔 ，后两遍可 用 180ul/孔）以去除多聚甲醛。洗板结束后每孔加入 IOOiUl D M E M -10 完全培养基。

7 . 将固定的细胞和杂交瘤细胞以及抗原共培养（见基本方案，步 骤 2〜5)。培养过夜后 ，检查培养板内 T 细 胞 的 活 力（残 留的固定液可能导致 T 细胞死亡）。

8 . 收集上清检测 IL- 2 水 平（见基本方案步骤 6〜 7 ) 。

备 选 方 案 2 用固定后的非贴壁型抗原呈递细胞检测加工处理过的抗原肽

附 加 材 料

转 化 的 B 细胞或其他非贴壁型细胞用作抗原呈递细胞。

D M E M 培 养 基（无血清）

2 % (m/V ) 多聚甲醛溶液，溶解 于 I3BS

赖氨酸洗液

15m l 以 及 50m l 无菌离心管

1 . 收集处于对数生长期的小鼠 B 淋巴瘤细胞， 400〜500&，室温，离 心 lOmin。 将细胞悬浮于无血清 DMEM (5 X IO⁶ 个细胞/ml) 。

2.加入等量 2 % 多聚甲醛溶液，室 温 孵 育 5〜lOmin， 400〜500 g ，室 温 ，离 心 lOmin，弃上清后将细胞悬浮于 D M E M 中（液体量应大于或等于固定液的量），再 次 400〜500 g ，室温，离 心 lOmin。

3 . 将 细 胞 悬 浮 于 赖 氨 酸 洗 液 中 ，室 温 孵 育 20〜 30 min。离 心 弃 上 清 后 ，将细胞用D M E M 洗 2 遍 。

4 . 细胞悬浮于 D M E M 完 全 培 养 基 中（2 X IO⁶ 个细胞/ml)，将 细 胞 加 入 9 6 孔平底培养板（2 X 10⁵ 个细胞/孔）。

5 . 将固定的细胞和杂交瘤细胞以及抗原共培养（见基本方案，步 骤 2〜5)。培养过夜后 ，检查培养板内 T 细 胞 的 活 力（残留的固定液会导致部分 T 细胞死亡）。

6 . 收集上清检测 IL- 2 水 平（见基本方案，步 骤 6〜7) 。

备 选 方 案 3 蛋白抗原致敏的细胞固定后检测抗原加工和处理

附 加 材 料

2 % (m /V ) 多聚甲醛溶液，溶 解 于 PBS

赖氨酸洗液

1.将 抗 原 呈 递 细 胞（如分离的腹腔巨噬细胞）以 2 X 10⁵ 个细胞/孔 加 入 到 9 6 孔平底培养 板 ，培 养 使 之 贴 壁（如 巨 噬 细 胞 需 37°C 培 养 2 h )。吹打上清后将上清替换为
DMEM -IO 完 全 培 养 基（IOOm I/孔）。

2 . 用 D M E M -1 0 完全培养基连续梯度稀释抗原，抗原浓度需大于工作浓度的 2 倍 。将稀释的抗原加入铺有抗原呈递细胞的培养板（100ul/孔），包括两排无抗原对照孔(见 步骤 7)。 37°C 培 养 一 段 时 间（如对于活化的腹腔巨噬细胞，需 培 养 2 h)。

3 . 培养结束前，将等量的无血清 D M E M 和 2 % 多 聚 甲 醛 溶 液 混 合（多聚甲醛浓度为1 % ) ，立即进入下一步操作。后 续 操 作 中 如 存 在 固 定 液 的 毒 性 问 题 ， 可 考 虑 使 用 低 浓 度 的 多 聚 甲 醛 溶 液(如 0 . 5 % )

4 . 吸弃培养上清，用 D M E M (200^1/孔）洗涤细胞一次，加 入 固 定 液（100ul/孔），室温固 定 10〜15 min。

5 . 用多道移液器吸弃固定液，加 入 120m 1/孔 D M E M ，为了防止固定液残留，枪头避免接触孔壁且避免固定液溅出。吸 弃 D M E M 并 加 入 赖 氨 酸 洗 液（120ul/孔）。室温孵育 20〜3Qmin。

6 . 用 D M E M 洗 板 4 次（所 用 D M E M 的量应逐渐加大，如前面两遍可加入 150ul/孔 ，后两遍可用 180u1/孔）以去除残余的多聚甲醛。洗板结束后每孔加入 IOOmI D M E M -1 0 完全培养基。

7 . 将 T 细胞杂交瘤细胞悬浮于 D M E M 完 全 培 养 基 中（IO⁶ 个细胞/ml)。加入细胞培养板（1 〇 ⁵个细胞/孔）。在 一 排 对 照 孔 内（未加抗原）加 入 20ul/孔的免疫原性肽作为阳性检测孔，其终浓度应为工作浓度的 1 0 倍（此时培养孔总体积为 220ul，但并不影响实验结果）。 37°C 培 养 20〜24 h 。

8 . 收集上清检测 IL-2 水 平（见基本方案，步 骤 6〜7)