基本方案1 培养以及小鼠外周血分裂相细胞收获实验

基本方案 培养以及小鼠外周血分裂相细胞收获

1.对于每一个小鼠标本，用一个 16 mm X 125 mm 组织培养管，其内有：

0.95 ml RPMI；

0.1 ml PHA 溶液；

0.1 ml LPS 溶液（750ug/ml);

0.15 ml FBS。

接种前需冷藏。

2.用两只 75u1 肝素化的微量毛细管分血器分别从每只小鼠的两个眼眶静脉窦采集血液 (图 4.2.1; 体重 30 g 的小鼠可采集 300u1 血液）。接种至含有 0.1 ml 500 USPU/ml 肝素钠的 12 mm X 75 mm 无菌管中。

注：如果不能熟练操作，可从小鼠尾静脉采血（备选方案 1)。

3.旋紧管盖，轻轻摇动管子，使血液与肝素充分混匀。室温保存（不超过 2 h)，直至接种至培养基。

4.接种 0.2 ml 肝素化血液至准备好的培养管中。旋紧管盖，轻轻摇动管子，使细胞与培养基混匀。

5.将培养管倾斜奶°角（倾斜有利于气体交换，且防止细胞沉积），于 3rc 水浴摇床培养 41?43 h。设置摇床前后转动速度为 32~35 次/min。平均每日至少用手摇匀培养管 3 次，使细胞重悬。

如果在染色体玻片上观察到大章的有丝分裂前期细胞（核大而苍白），表明细胞培养时间不充分。如果观察到多数分裂晚期染色体，表明培养时间过长。

6.于每一个培养管中加人 50ug/ml 的秋水仙素溶液 0.15 ml，继续 37℃ 培养 15~20 min。将培养基转移至 5 ml 锥形玻璃离心管，室温 400 g 离心 10 min。

7.弃上清，轻轻加入 2~3 ml 预热的 0.075 mol/L KCl，用巴氏管轻轻吹吸混匀细胞，37°C 孵育 15 mm。室温 500 g 离心 10 min。小心弃上清，勿触及下层沉淀之上的棕茜 (白色）色薄膜。

8.于管底轻轻加入固定剂 3~4 ml，轻柔但迅速吹吸使其充分混匀。旋紧盖子，室温静置至少 30 min，如有必要，可于 4°C 保存 2 h。

9.室温 400 g 离心 lOmin，弃上清（固定剂），加入新配制的固定剂 2?3m 卜混勻细胞。

重复此第 2 步次。

10.将细胞室温 400 g 离心 8 min 后，以 1/3~1/2 ml 新鲜固定剂重悬细胞。如果不立即制备染色体玻片，可不进行最后的步骤，直至制备玻片之前再进行。如果隔日制备玻片，过夜前应洗涤细胞至少 2 次。

11.制备染色体玻片目 ij，将玻片浸入固定剂 15 min 以上，用 Kimwipe 或不含棉绒纸擦干。

12.用巴氏管将小滴细胞悬液滴加至玻片上，并使其分散。如果在玻片边缘出现水泡，则应减少滴加量。一旦液滴开始收缩，出现牛顿环（液滴边缘出现彩虹颜色，因色差而起着色现象），应立即吹干或摇动玻片使其迅速晾干，此步骤对于获得分散良好的中期染色体至关重要。、选择方案：要增加染色体的分散度，可将玻片平置，在细胞悬液开始晾干时滴加很小的一滴固定剂（如「炸弹，，方法）。

13.重复第 12 步，直至将所有样品都滴加至玻片上（多加几滴稀释的细胞悬液的效果优于只加几滴浓缩的细胞悬液），于相差显微镜下观察细胞的浓度以及染色体的分散程度。以细胞的浓度来评价玻片制备的优良，而不是以分裂相的多少作为指标。

14.在进行 G 显带之前，可将玻片在室温保存 7~10 d(基本方案 2)。进行 FISH 分析，可室温存放玻片 2?4 周（本文作者应用干燥器），以防止过度变性。如要长期保存 (如 4 周至 1 年），应将玻片-20°C 冷冻保存。

备选方案1 由尾静脉采集血液

备选方案2 由胚胎肝脏制备染色体

支持方案 小鼠定时交配

备选方案3 由骨髓制备染色体

备选方案4 从成体组织或实体瘤组织制备染色体